桫椤科笔筒树游动精子行为及形态观察

纪善博，向建英，刘保东,*，计红玲

(1 哈尔滨师范大学，哈尔滨 150025；2 西南林业大学 云南生物多样性研究院，昆明 650224；3 黑龙江省普通高等学校植物生物学重点实验室，哈尔滨 150025)

桫椤科(Cyatheaceae)是侏罗纪孑遗的唯一树状蕨类，在生态适应、系统演化等研究领域有独特而重要的价值，中国产桫椤共3属14种，主要分布在云南、广西、广东、海南、台湾等省区，都曾因生境的破坏而不断濒危，受到国家重点保护[1]。随着生境的改善，近年来多数居群的植株长势均有显著好转[2]，但多数种类又都出现了幼苗数量较少、生殖障碍加剧等新的濒危趋势[3]。

精卵结合是蕨类有性生殖的关键环节，真蕨类植物的精子都是没有细胞壁的单细胞、单倍体，需在水中游动并感知雌性物质的浓度而游进颈卵器完成受精作用[4]。以往关于蕨类精子的研究主要集中在精原细胞、精母细胞、成熟精子等各阶段的超微结构[5-8]、形态发生[9-10]等方面，包文美等[11]对荚果蕨(Matteucciastruthiopteris(L.) Todaro)等做了精子形态观察、戴锡玲等[12]对水蕨(Ceratopteristhalictroides(L.) Brongn.)精子由精细胞至游动精子的变化过程有过报道，都表明精子的结构对有性生殖起决定性作用。Sakaushi等[13]报道了海金沙(Lygodiumjaponicum(Thunb.) Sw.)精子的鞭毛数、游动方向及超微结构，从系统学的角度把精子与单细胞移动藻类进行了演化关系的讨论。许冰等[14]对球子蕨(OnocleasensibilisL.)的精子行为也有过简单报道，但缺乏图像信息；就高等植物而言，种子植物精子的研究已经深入到基因调控层面[15]，苔藓植物精子已经进行了动力学分析[16]，但对桫椤科植物精子的游动行为及其游动过程中的形态结构变化、精子对水媒介物质的感知等方面尚无报道。而阐明桫椤类植物由精细胞至精子的完整变化过程、精子的行为和结构，既是生殖生物学的基本补充，也是保护该科植物的必要环节。

笔筒树(Sphaeropterislepifera(Hook.) R. M. Tryon)为中国桫椤科的重要物种，广泛分布在台湾省各地山区，在华南地区有少量引种栽培。近年来，台湾的野生种群遭受大面积病害[17]，其生殖发育特征及其濒危趋势受到了广泛关注。本研究通过孢子培养获得成熟配子体，对精子器的发生、精细胞的发育、精子行为、精子结构等进行了细致观察，以期为中国桫椤科植物有性生殖研究、濒危趋势评估提供参考资料。

1 材料和方法

1.1 材 料

笔筒树的孢子采自深圳仙湖植物园栽植10年以上的健康成熟植株，凭证标本现存于哈尔滨师范大学植物标本室(HANU)，孢子处理方法同曹建国等[9]。

1.2 方 法

取黑龙江省东部山区阔叶林下暗棕壤，按水∶土为2∶1的质量比提取浸出液，用该浸出液配制1/2MS半固体(琼脂占8‰)培养基，接种消毒后的孢子，置于20～28 ℃、光强50～80 μmol·m-2·s-1条件下培养至配子体成熟。在OLYMPUS SZX2-FOF实体显微镜下挑取有较多精子器的成熟配子体于载玻片上，滴加20～24 ℃的蒸馏水，置OLYMPUS BX53显微镜下观察精细胞的释放、精子的行为并吸取游动精子，用改良Noland染色液染色。改良Noland染色液的染色观察法拟另文报道。精子器产精量、精子游动速度、精子自转频率等，均给出10个数值的范围或平均值。

2 观察结果

2.1 精细胞的逸出

笔筒树配子体自50日龄起陆续产生精子器，精子器需5～8 d才能发育成熟，成熟的精子器呈截球型，直径约50 μm，内部精细胞轮廓清晰，数量为38～45个。遇水后成熟精子器的壁细胞吸水膨胀，引起盖细胞缝裂，球形精细胞自裂缝处逐个逸出。精子器释放用时约6～10 min，释放的速度先快后慢(图1)。多数精子器内会留有1～2个精细胞不能逸出，于精子器内转化为游动精子。精子器成熟后若不能接触明水，则始终无法释放精细胞，3～4 d后精子器过熟，遇到明水也能释放精细胞，只是精细胞不能转化为游动精子。

2.2 精子运动行为

自精子器逸出的精细胞最初是不能运动的球形，15～30 s后，精细胞的细胞膜被水溶解，精子开始迅速运动，运动方式包括逆时针自转和向前位移；游动精子可分为3个时期：初游期(initial period)、平稳期(stable phase)和衰亡期(idecline period)。初游期即精细胞转变为精子开始，至自转速度和位移速度达到最大值时为止，时长约1～3 s，最大自转频率约200 r·min-1，最大位移速度约130 μm·s-1；平稳期即精子维持最大自转频率和位移速度的时期，持续约17～20 min；衰亡期即精子自转频率和位移速度逐渐降低、直至静止的时期，约5～7 min。

精子自挣脱质膜束缚后迅速沿逆时针方向自转，频率于初游期结束时达到最大，平稳期自转频率基本保持稳定，衰亡期自转频率缓慢降低，5～7 min后精子停止自转，鞭毛仍保持5～10 s的不规则颤动直至静止死亡(图2)。

每精子器平均逸出精细胞42(38～45)个图1 笔筒树精细胞自精子器逸出速度Per antheridium expelled 42 (38～45) sperm cells on averageFig.1 The speed of Sphaeropteris lepifera sperm cells escaping from antheridium

图2 笔筒树精子的自转频率Fig.2 The frequency of S. lepifera sperm rotation

图3 笔筒树精子的位移速度Fig.3 S. lepifera sperm’s displacement velocity

伴随精子自转频率的升高，精子位移速度于初游期结束时达到最大；平稳期精子游动速度基本保持稳定，可在三维空间内随机变换方向，但笔者没发现后退现象，即使遇到假根等障碍而原位转动，也不后退；衰亡期的精子位移速度逐渐降低，最终静止死亡(图3)。

2.3 精子各时期形态

逸出的精细胞呈球形，直径约6～8 μm，暂不能运动(图版Ⅰ, 1)，自精子器逸出15～30 s后，细胞膜逐渐被水溶解变薄并被精子挣脱，质膜破裂后，高度螺旋的精核于0.5 s内向横向及纵向同时弹开，侧面观表现为精核螺距增加(图版Ⅰ, 2)，顶面观表现为精核螺旋直径扩大(图版Ⅰ, 3)，精核初解旋过程中存在鞭毛呈轮状排列的瞬间(图版Ⅰ, 4)，随着鞭毛的舒展，精子立即开始运动，自转频率及位移速度快速增加，精核进一步解旋，尾部可见直径约5～7 μm由囊泡组成的泡状体(图版Ⅰ, 5)。平稳期精子精核及鞭毛舒展程度达到最大，呈长10～13 μm、直径2～3 μm、螺旋2.5～3.5圈的“s”形，前端脊部可见染色较深、长约6～8 μm的顶脊，泡状体随运动而逐渐萎缩(图版Ⅰ, 6)。衰亡期精子逐渐缩短至8～10 μm，泡状体消失并静止死亡(图版Ⅰ, 7)。

2.4 精子游动的方向性及死亡

本研究在人工添加不同浓度钙盐(拟另文发表)后发现，精子具有一定的驱化性，即在一定的浓度范围内，精子能由低浓度向高浓度定向移动(图版Ⅰ, 8、9)。偶有小部分精子(≤10%)在衰亡期游动过程中突然解体死亡，解体后精核螺旋打开为长度约17～22 μm的棒状，或两端稍有弯曲，部分解体精子鞭毛带脱落，精核与鞭毛带分离，仅在顶端相连(图版Ⅰ, 10)，精核不均质(图版Ⅰ, 11)，鞭毛带长8～10 μm，其上有规律地着生有32～48条基本等长、长度约9～11 μm的尾鞭型鞭毛(图版Ⅰ, 12)。偶见鞭毛分枝为近十条纤丝、仅基部紧密相连的束状体(图版Ⅰ, 13)。

3 讨 论

图4 真蕨精子结构模式图[18]Fig.4 The idepgreph of filicinae sperm[18]

本研究综合笔筒树和其他真蕨类[5,7-14,18-22]的精子特征，将其模式化如图4，即由顶脊(apical ridge)、鞭毛带(flagellar band)、鞭毛(flagella)、精核(sperm-nucleus)和泡状体(vesicle)等5部分组成。顶脊位于精子前部,染色较深，在以往研究中曾被称为“无毛部”(border-brim)[18]、密集脊(dense ridge)[19]、顶端“s”型结构[22]，在傅氏凤尾蕨(Pterisfauriei)中被称为顶脊[7]，本研究因其存在于精子前端脊部，认为将其称为顶脊较为合适。很多学者认为顶脊有维持精子空间结构的作用[7,23]。刘宁等[23]曾认为精子鞭毛数量在演化过程中有增多的趋势，结合过去关于鞭毛数量的研究，石松属(LycopodiumL.)[18]、水韭属(IsoetesL.)[6]、荚果蕨(Matteucciastruthiopteris(L.) Todaro)[11]、傅氏凤尾蕨(Pterisfauriei)[7]和苹属(MarsileaL.)[18]的鞭毛数分别为2条、12～20条、32～40条、70～80条和140条，本研究观察到笔筒树鞭毛32～48条，根据鞭毛数判断笔筒树的进化程度应该与荚果蕨[Matteucciastruthiopteris(L.) Todaro]较为接近，与秦仁昌分类系统基本吻合。

许冰等[14]指出，极低浓度的洗衣粉便会导致球子蕨(OnocleasensibilisL.)精子鞭毛脱落，周云龙等[20]发现蕨[Pteridiumaquilinum(L.) Kuhn]精子对化学物质刺激较为敏感，李晓东等[6]认为精子寿命短、个体微小可能是水韭(IsoetesL.)濒危的原因，而笔筒树精子同样对化学物质敏感、寿命短、个体微小，且存在精细胞无法全部逸出、鞭毛易脱落等问题，本研究认为，笔筒树等桫椤类植物出现的幼苗减少等生殖障碍问题可能与其精子的特性有关，在污染条件下可能更为明显，因此建议有必要进行污染条件下桫椤科生殖状况的相关研究。

关于泡状体的报道较多，综合前人的研究并结合笔筒树精子的观察，似乎可以将其分为如下3种类型：球子蕨(OnocleasensibilisL.)、荚果蕨[Matteucciastruthiopteris(L.) Todaro][11]等精子泡状体在游动过程中始终存在，即宿存型(always existence type)；绵马鳞毛蕨(Dryopteriscrassirhizoma)[10]等的精子摆脱质膜及泡状体后才成为游动精子，Ceratopterisrichardii[5]精子的泡状体会在精细胞游动一段时间后与精核分离，即脱离型(abscission type)；笔筒树精子游动过程中泡状体附着于尾部，随运动时间的延长而逐渐萎缩，即萎缩型(atrophy type)。

不同蕨类释放精细胞的方式有所不同，蕨[Pteridiumaquilinum(L.) Kuhn][20]的释放方式为批次排出、无法排尽，对开蕨[Phyllitisscolopendrium(L.) Newm.][21]的释放方式为逐个逸出、可全部逸出，本研究观察到笔筒树精细胞逐个逸出、多数无法排尽；精子运动方面，笔筒树精子不能后退，海金沙[Lygodiumjaponicum(Thunb.) Sw.][13]精子游动行为中也发现了精子缺乏向后运动的能力，结合单细胞藻类的鞭毛类型[24]和灵活改变运动方向的关系，本研究推测蕨类精子不能向后运动可能与缺少绒鞭和尾鞭的分化[20]有关。真蕨类精子对游动方向的选择存在明显的趋化性，有学者指出部分真蕨类精子对苹果酸、柠檬酸存在趋化性[18]，并认为精子依靠化学诱导而进入颈沟，也有些学者认为精子通过改变自身的形态结构而进入颈沟[8]，本研究也观察到笔筒树精子对钙盐存在明显的趋化性，同意精子依靠化学物质诱导完成受精的观点[18]。

一些研究表明，蕨类精子鞭毛带只是着生鞭毛、辅助运动的结构，并无染色质分布[5,7,9-10]，对于精子而言，只有精核才包含遗传物质，考虑到蕨类受精孔直径仅2～3 μm[25]，与螺旋的精核直径相当，而鞭毛方向各异、长度普遍超过8 μm[5-6,11]，不易通过受精孔，因此本研究认为在受精过程中是精核与卵结合，鞭毛带和鞭毛不进入受精孔，并推测笔筒树精子鞭毛带易与精核发生分离可能有助于完成受精。此外，通常认为电子显微镜下才能观察到鞭毛的组成结构，但本研究用油镜在分枝为束状体的鞭毛中也初步观察到类似“9+2”的结构(“9+2” pattern)[26]，与真蕨类的相关研究结果相同[23]，而基部未发生分叉的现象正与曹建国等[7]发现鞭毛基部存在电子致密的塞相印证。精核不均质现象可能与遗传功能不同有关。

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图版Ⅰ 笔筒树[S. lepifera (Hook.) R. M. Tryon]精子的运动及死亡形态1.精细胞；2.精细胞侧面观；3.精细胞顶面观；4.精子开始运动；5.初游期精子；6.平稳期精子；7.精子死亡；8～9.精子的趋化性；10.精核与鞭毛带分离；11.精核不匀质；12.脱落的鞭毛带及鞭毛；13.鞭毛分枝为束状体PlateⅠ S. lepifera (Hook.) R. M. Tryon sperm’s movement and death morphologyFig.1. Sperm cell；Fig.2. Sperm cell norma lateralis；Fig.3. Sperm cell apical view；Fig.4. Sperm start motion；Fig.5. Initial period sperm；Fig.6. Stable phase sperm；Fig.7. Sperm death；Fig.8-9. Chemotaxis of sperm；Fig.10. Separation of sperm-nucleus and flagellar band；Fig.11. Sperm-nucleus unevenness；Fig.12. Shedding flagellar band and flagella；Fig.13. Flagella branch to fasciculation