铜胁迫下白三叶种子萌发及根系生长研究

张鹤山， 王志勇， 张志飞， 田 宏， 熊军波， 陆娇云， 刘 洋

(1.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所， 武汉 430064； 2.信阳农林学院， 河南 信阳 464006；3. 湖南农业大学， 长沙 410128)

铜(Cu)是动植物生长发育的必要微量元素，但是在土壤环境中的过量积累能够造成土壤重金属污染。随着饲料工业中高铜制剂的加入，含铜农药、化肥如三氯酚铜、铜锌合剂、硫酸铜等的使用，工业废水、铜矿废弃场的Cu2+经水体在土壤中积累，造成土壤铜含量超标。据报道，湖北大冶市铜绿山矿区附近土壤铜含量超过5 000 mg·kg-1，浙江哩铺铜矿区土壤中铜含量超过7 000 mg·kg-1[1]。在国外，许多果园土壤中的铜含量也高于背景值很多倍，如巴西的某可可种植园表层土壤铜含量接近1 000 mg·kg-1，高于对照50多倍；法国有些葡萄园中的全铜含量达到1 280 mg·kg-1[2]。因此，如何修复铜污染土壤是人们关注的焦点。

目前铜污染土壤的修复措施包括电动修复、固化/稳定修复、动物修复、植物修复、微生物修复和农业生态修复等措施，而植物修复技术因其利用植物及其根际微生物对土壤污染物吸收、提取、分解、转化和固定，被学术界称为“绿色修复”，近年来备受关注。一些耐铜性或能够富集Cu2+的植物如海洲香薷(Elsholtziaharchowensis)[3]、蕨类植物[4]、鸭跖草(Commelinacommunis)、星香草(Haumaniastrumrobertii)已经在土壤铜污染修复中得到应用；牧草类物种如多花黑麦草(Loliummultiflorum)、苇状羊茅(Festucaarundinacea)、高丹草(Sorghum.bicolor×Sorghum.sudanense)、杂交狼尾草(Pennisetumamericanum×P.Purpureum)、紫花苜蓿(Medicagosativa)等草种也成功用于土壤重金属污染的修复[5-8]。白三叶(Trifoliumrepens)作为一种优良的豆科牧草，繁殖力强，生物量大，并能在贫瘠的土壤中生长，管理成本低；此外白三叶还是常见的草坪草或边坡绿化草种，在修复污染土壤的同时还可以起到美化环境的作用。因此，在生产中已经利用白三叶进行铜尾矿区或养殖场周边土壤重金属污染的修复[9-10]。

高Cu2+浓度胁迫影响植物细胞渗透压，使细胞膜受到氧化损坏[11]。白三叶对土壤中Cu2+的耐受强度决定着修复措施的成败。鉴于此，本研究以鄂牧1号白三叶为研究对象，研究不同Cu2+浓度胁迫对白三叶种子萌发和根系发育的影响，旨在探讨白三叶对于Cu2+胁迫的临界浓度，为在铜污染土壤上进行白三叶生产及土壤修复提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验品种为鄂牧1号白三叶，由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所提供。供试试剂为分析纯CuSO4·5 H2O。

1.2 试验方法

Cu2+浓度设0、5、10、50、100、200、400、800 mg·L-1共8个梯度，pH值5.5；对照为去离子水处理；每处理4次重复，每重复50粒种子。

选取健康饱满的白三叶种子，用浓度0.1%高锰酸钾溶液浸泡15 min，用蒸馏水冲洗干净，然后用滤纸将种子表面水分吸干。采用滤纸发芽法于人工气候箱中进行发芽试验(20 ℃，16 h，光照/20 ℃，8 h，黑暗)，每个发芽盒铺设2层滤纸，均匀放置50粒种子，并加入25 mL处理溶液，对照组(ck)加25 mL去离子水。每隔24 h统计1次发芽的种子数，以胚根突破种皮并长于种子长度为发芽标准。记录10 d内白三叶种子的发芽数，并在发芽结束后选取10颗幼苗进行胚芽和胚根测定。

1.3 测定指标

发芽势(%)=(试验第4天正常发芽的种子数/供试种子总数)×100%；

发芽率(%)=(发芽种子数/供试种子总数)×100%；

发芽指数=∑(Gt/Dt)，式中，Gt为处理t日的发芽数，Dt为相应的发芽天数；

活力指数=发芽指数×根长；

根长度、根系体积、根系表面积、根系平均直径等指标利用植物根系分析仪进行扫描分析。

1.4 数据处理

利用SPSS软件进行数据处理和统计分析。采用单因素LSD法对不同处理条件下各指标进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 Cu2+对白三叶种子萌发的影响

不同Cu2+浓度胁迫下白三叶萌发特性见表1。随着Cu2+胁迫浓度的增加，白三叶发芽率和相对发芽率表现出整体下降的趋势，但在5 mg·L-1浓度处理下，其发芽率较对照增加3.3%，说明低浓度的Cu2+胁迫可以促进白三叶种子的萌发，这一现状在多个植物种内被发现[12-14]。在Cu2+胁迫浓度达到10 mg·L-1以后，发芽率开始降低，在100 mg·L-1浓度时显著下降(p<0.05)；此后发芽率跳跃式下降，在Cu2+胁迫浓度达400 mg·L-1时，其发芽率仅为2.0%，相对发芽率也仅为2.2%。

表1 不同Cu2+浓度对白三叶种子萌发的影响

在不同Cu2+胁迫下，发芽指数表现出与发芽率一致的变化趋势，在Cu2+浓度为100 mg·L-1时发芽指数显著降低(p<0.05)，而Cu2+浓度在0～50 mg·L-1范围内时，发芽指数在各处理间差异不显著，但此后每个Cu2+胁迫浓度间均差异显著。发芽势和活力指数在Cu2+胁迫浓度增加时具有基本一致的变化趋势(表1)。Cu2+胁迫显著影响了白三叶种子的发芽速度，在浓度为10 mg·L-1时发芽势即显著下降(p<0.05)，而活力指数在Cu2+胁迫浓度为50 mg·L-1时显著降低。

2.2 Cu2+对白三叶根系的影响

根系是植物能够正常生长的关键部位，发育良好的根系可以提高植物的抗逆能力。本研究中，Cu2+胁迫显著影响了白三叶根系的生长(表2)。白三叶根长随Cu2+胁迫浓度增加而降低，在50 mg·L-1浓度时达到显著差异(p<0.05)，并在50～400 mg·L-1范围内，各处理间根长度并无显著差异。与根长度的变化趋势一样，根表面积在50 mg·L-1浓度时也出现显著下降(p<0.05)，并在此后缓慢下降，处理间无显著差异。

表2 不同Cu2+浓度对白三叶根系的影响

相比对照，根系体积在5～10 mg·L-1浓度范围内逐渐增加，但随后大幅度下降；在50 mg·L-1时根系体积显著降低(p<0.05)，在Cu2+胁迫浓度为400 mg·L-1时其根系体积为0.26 mm3，为对照的50%，但在50～400 mg·L-1范围内各Cu2+胁迫处理间并无显著差异。根系平均直径在Cu2+胁迫下不同程度地增大，其中在10 mg·L-1时根系平均直径最大，为0.47 mm，较对照增加了17.5%，说明Cu2+胁迫抑制了根系的生长，使得根系变粗，变短。

2.3 不同Cu2+浓度下白三叶发芽率和根长度的回归分析

发芽率和根长度是白三叶种子受胁迫时的主要特征指标，本研究对不同Cu2+胁迫下的白三叶的相对发芽率和根长度进行回归分析，结果(图1)表明，不同Cu2+浓度与相对发芽率和根长度的回归模型均呈指数关系。根据相对发芽率的回归模型y=127.7 e-0.01 x(R2=0.968 4)，白三叶Cu2+胁迫半致死浓度(相对发芽率为50%)为93.7 mg·L-1，绝对致死浓度(相对发芽率为10%)为254.7 mg·L-1。而根长度为对照50%时的Cu2+胁迫浓度为238.6 mg·L-1，但是在Cu2+胁迫浓度为50 mg·L-1时，根长度呈现“断崖式”降低，严重影响幼苗发育。

图1 不同浓度Cu2+胁迫下白三叶相对发芽率和根长度变化趋势

3 讨 论

植物种子萌发是幼苗发育生长的先决条件。本研究对白三叶种子在不同浓度Cu2+胁迫下的种子萌发和发育特征进行了研究。在低Cu2+浓度下(5 mg·L-1)白三叶种子发芽率略有提高，但并未达到显著水平；在Cu2+浓度为100 mg·L-1时，白三叶种子发芽率显著下降，发芽率为对照的76%，并且与对照差异显著(p<0.05)，这一结果与赵玉红等[13]对重金属胁迫下的白三叶发芽率研究结果一致。但是，关于白三叶耐受Cu2+胁迫的敏感浓度并没有一致的结论，陈雪梅等[15]在研究白三叶Cu2+耐受性时发现，Cu2+浓度在20 mg·L-1即可显著降低白三叶发芽率；而宋凤鸣等[16]发现，Cu2+浓度达到400 mg·L-1时才能显著降低白三叶发芽率；而本实验在Cu2+浓度超过100 mg·L-1时白三叶种子发芽率才显著降低，这可能与试验选用的试验材料有关。

根据白三叶相对发芽率回归方程，鄂牧1号白三叶对Cu2+胁迫的半致死浓度为93.7 mg·L-1，绝对致死浓度为254.7 mg·L-1；相对根长为50%时的Cu2+浓度为238.6 mg·L-1。白三叶根长在Cu2+浓度达到50 mg·L-1时即显著下降，并且同时根表面积和根系体积显著减少，而根系平均直径则显著增加，说明白三叶根系对Cu2+胁迫更为敏感。实验中发现，虽然幼苗仍有胚芽生长，但子叶发黄，胚根几乎没有发育，幼苗无法继续正常生长，这一结果与紫花苜蓿种子在Cu2+胁迫下的表现较为一致[12]。许多研究表明，低浓度的Cu2+对种子萌发抑制作用不明显，但对根发育具有显著抑制作用[17-18]，这也说明重金属Cu2+对白三叶种子萌发的影响主要体现在抑制根生长[19]，并且这种影响是不可恢复的；另一方面也说明白三叶根系发育对Cu2+胁迫更为敏感。

尽管本研究中白三叶在Cu2+浓度为50 mg·L-1时根系即受到显著抑制，但在实际生产中铜含量超过这个值时白三叶能够正常生长[9]，这可能是由于种子萌发时为游离态的Cu2+，而在土壤中还有复合态的铜存在。研究证明，白三叶不仅作为单一群落能够对土壤铜污染进行修复，而且还可以促进其他植物对土壤中重金属的吸收，比如混种白三叶可以有效提高假繁缕(Pseudostellariamaximowicziana)植物对铬、铜和镍等重金属的吸收[20]，鄂牧1号白三叶是否可以促进其他植物对重金属的吸收尚需进一步的研究。

4 结 论

鄂牧1号白三叶在Cu2+胁迫下，种子萌发指标和根系指数均受到不同程度的影响，其中低浓度Cu2+(5 mg·L-1)可以促进种子发芽，在100 mg·L-1浓度时发芽率显著降低，相对发芽率半致死浓度为93.7 mg·L-1，绝对致死浓度为254.7 mg·L-1。这一结果可作为白三叶幼苗耐铜性研究的筛选浓度。

种子胚根发育受Cu2+胁迫较为敏感，Cu2+浓度在50 mg·L-1时即可显著抑制白三叶根系发育；在Cu2+浓度达238.6 mg·L-1时其相对根长为50%。