牡丹DGAT基因的克隆及表达分析

崔 波，王若斓，郝平安，程邵丽，袁秀云，张 燕

(1 郑州大学 生命科学学院， 郑州 450001；2 郑州师范学院 生物工程研究所， 郑州 450044；3 河南农业大学 生命科学学院， 郑州 450002)

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)是芍药科(Paeoniaceae)芍药属(Paeonia)多年生落叶小灌木，是中国的传统名花[1]，有着很高的观赏和营养保健价值。近年来发现牡丹可作为一种粮油资源进行开发和利用。牡丹籽油中富含不饱和脂肪酸，2011年国家卫生部批准牡丹籽油作为新资源食品，随着牡丹籽油产业化的发展，牡丹的研究与开发成为油用植物研究的新热点[2]。

二酰甘油酰基转移酶(diacylglycerol acyltransferase, DGAT)与脂肪代谢、脂类在组织中的沉积有很大关系，它的主要作用机制是催化三酰甘油TAG合成途径的最后一步，并且从乙酰辅酶A中转移一个酰基集团到甘油二酯DAG中，从而形成三酰甘油TAG[3]。三酰甘油TAG是动物、植物和真核微生物的主要贮藏脂。在植物中，三酰甘油TAG的合成对种子油脂的形成十分重要[4]。该酶广泛存在于植物的不同器官中，如叶片、花瓣、果实、花粉囊以及正在发育中的种子中[5]。截至目前，人们共发现了4种DGAT基因类型，分别是DGAT1、DGAT2、DGAT3和WS/DGAT[6]，其中，DGAT1和DGAT2主要存在于真核生物中，随着Hobbs等[5]在拟南芥中克隆到DGAT1基因后，DGAT1的同源基因又在油茶[7]、蒺藜苜蓿[8]等其他植物中得到，Jako等[9]在拟南芥中过量表达DGAT1 基因后发现，DGAT1表达量和活性均提高10% ～ 70%，含油率和种子的平均重量也明显有所增加。DGAT2编码的蛋白质与DGAT1蛋白同源性极低，而且在基因结构、酶学活性及特异性等方面都存在巨大差异[10]。通过研究DGAT2基因的功能发现，DGAT2基因具有底物特异性，优先利用特殊脂肪酸进行三酰甘油合成，DGAT3基因所编码的蛋白序列与DGAT1和DGAT2亚家族的同源性较低，但仍然具有DGAT蛋白的功能基序[11]，目前该基因已在拟南芥中被鉴定出来[12]。WS/DGAT基因在革兰氏阴性菌不动杆菌属ADP1中首次被鉴定，发现当其生长受限时可以合成蜡酯和甘油三酯[13]，在拟南芥中也被鉴定出WS/DGAT基因可以显著促进蜡酯合成[14]。可见，这4种不同类型的DGAT基因对控制生物体内的油脂合成发挥着重要作用。

目前，尽管人们在很多的植物中都已经克隆得到不同类型的DGAT基因，但是，牡丹DGAT基因的研究还未见报道。本研究以牡丹种子为试验材料，利用RT-PCR和RACE技术克隆DGAT基因，并对其进行生物信息学分析，在牡丹种子的不同发育过程、后熟阶段及不同组织器官中，对该基因的表达量进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析，旨在进一步理解DGAT基因在牡丹种子油脂合成中的调控作用，并为今后利用基因工程手段及在生产实践中提高其脂肪酸含量提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 植物材料

试验材料为牡丹品种“凤丹”，由郑州师范学院生物工程研究所提供。取牡丹花蕾期的叶片、花芽、未发育子房及嫩茎各组织，用于DGAT基因的组织器官表达特异性分析；从2017年4月底牡丹花败后开始采摘直到7月底，选取生长状态一致的牡丹植株，每2周取其种子，用于种子不同发育过程中DGAT基因的表达分析；7月底将种子采收并常温自然保存后，以采收当天的种子作为对照(CK)，每7 d取1次，共取4次，用于牡丹种子后熟阶段中DGAT基因的表达差异性分析。每次取3株上的样品作为3个生物学重复，液氮速冻后保存于-80 ℃超低温冰箱中备用。

1.2 方 法

1.2.1总RNA提取和cDNA合成牡丹种子总RNA用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(Tiangen)提取，具体方法参照说明书进行。提取的RNA用质量分数为1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性；用 Q5000 核酸蛋白分析仪(美国 Quawell)测定提取RNA的浓度和纯度。利用 M-MLV反转录酶(TaKaRa)对总 RNA进行反转录，合成单链cDNA，用于DGAT基因的克隆，具体方法参照试剂盒的说明书。

1.2.2牡丹DGAT基因全长的克隆利用生物学软件DNAMAN和Primer premier 5.0，根据NCBI已登录的植物DGAT基因序列，设计1对简并引物DGAT-F(5′-TTGCTAAGTCAG TTGATAAGG-3′)和DGAT-R(5′-TTGGCTGGTAACATAACG-3′)，以反转录合成的cDNA第一链为模板扩增牡丹DGAT基因保守片段。PCR扩增体系为20.0 μL，包含10×PCR Buffer 2.0 μL，dNTP(2.5 mmol/L)1.6 μL，上下游引物(10 mmol/L)各1.0 μL，模板cDNA 1 000～2 000 ng，r-Taq DNA聚合酶(5U)0.2 μL。PCR扩增程序为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，进行35个循环，最后72 ℃延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶检测后，利用凝胶试剂盒(Tiangen)回收目的片段，连接到pGEM-T Easy载体上，转入大肠杆菌DH5α菌株，进行克隆和测序。

根据获得的中间片段序列，设计1对3′端特异性引物，DGAT3-1(5′-CGTTATGTTACCAGCCAACCTATC-3′)和DGAT3-2(5′-GTTCTACTGCCTTTTTCACCTCTG-3′)，1对5′端特异性引物DGAT5-1(5′-CATCCCCCTTATCAACTGACTTAGC-3′)和DGAT5-2(5′-AACCACACAATGCAAGCACAGAG-3′)，按Clontech公司SMARTTMRACE Amplification Kit操作说明进行扩增，回收产物，连接到pGEM-T Easy 载体上，然后转入大肠杆菌 DH5α菌株，鉴定后测序，并与中间片段进行拼接。

依据拼接序列设计1对引物DGAT-ORFF(5′-AGCTCTTTTTCCCGGCATCA-3′)和DGAT-ORFR(5′-AGCCACGCCAATGAGATCTGT-3′)，进行开放阅读框(ORF)扩增。引物合成和测序由英潍捷基(上海)贸易有限公司完成。

1.2.3牡丹DGAT基因的生物信息学分析用DNAMAN软件对序列进行拼接，得到正确的牡丹DGAT基因的全长序列。在NCBI上进行蛋白保守结构功能域和氨基酸同源性比对分析；利用ProtParam 软件预测编码蛋白的理论分子量和等电点等基本理化性质；利用ProtScale 软件预测蛋白亲疏水性；利用ExPASy网站在线预测蛋白质二级结构；使用MEGA软件的邻接法构建系统进化树。

1.2.4牡丹DGAT基因的表达分析表达分析样品的总RNA用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa) 试剂盒反转录以合成单链 cDNA。根据牡丹DGAT基因的编码区序列，设计1对特异性引物qRT-DGATF(5′-ATGTTACCAGCCAACCTATCCTC-3′)和qRT-DGATR(5′-GGATGCTGAGAGTTCTGGACAATA G-3′)，以Actin(JN105298.1)为内参基因，引物分别为Act-F(5′-AAGTCCTGTTCCAGCCATCACTA-3′)和Act-R(5′-TACTGAGGGAAGCAAGAATAGACC-3′)，采用SYBR Premix ExTaqTMⅡKit(TaKaRa)进行qRT-PCR反应。反应体系为 20 μL，反应程序为95 ℃预变性15 s，58 ℃变性15 s，72 ℃退火15 s(40个循环)，反应在荧光定量PCR仪(Eppendorf)上进行，每个样品重复3次，通过公式2-ΔΔCt法计算基因相对表达量，DGAT基因表达的差异分析通过SPSS 17.0软件进行。

2 结果与分析

2.1 牡丹DGAT基因全长的克隆

以牡丹种子的cDNA为模板，利用设计的简并引物DGAT-F和DGAT-R进行保守区的PCR扩增，得到1个长度为728 bp保守片段(图1，A)，并在NCBI上进行Blastn分析，确定该片段为DGAT基因片段。根据该片段序列，采用RACE技术，利用3′端特异性引物DGAT3-1和DGAT3-2扩增得到3′端目的片段(图1，B)，利用5′端特异性引物DGAT5-1和DGAT5-2扩增得到5′端目的片段(图1，C)。将中间片段、3′端和5′端目的片段进行拼接，在开放阅读框区域设计引物，进行扩增验证，得到预期的片段(图1，D)，最终得到1条全长为2 028 bp的完整牡丹DGAT基因的cDNA序列。在NCBI上进行ORF搜索，该基因具有完整的开放阅读框，其中，包含250 bp的5′-UTR、1 554 bp的开放阅读框和224 bp的3′-UTR，编码517个氨基酸(图2)。将其命名为PaDGAT1，GenBank登录号为MG214258。

M. DL2000；1. 保守片段；2. 3′-RACE；3. 5′-RACE；4.开放阅读框片段图1 牡丹PaDGAT1基因的扩增M. DL2000；1. Conserved region；2. 3′-RACE；3. 5′-RACE；4. ORF；Fig.1 Amplification of PaDGAT1 gene in Paeonia suffruticosa

ATG. 起始密码子；TAA. 终止密码子图2 牡丹PaDGAT1基因核苷酸序列和推测的氨基酸序列ATG. Start codon；TAA. Stop codonFig.2 The nucleotide acid sequence and deduced amino sequence of PaDGAT1 gene in P. suffruticosa

2.2 牡丹DGAT基因的生物信息学分析

利用NCBI的蛋白数据库对PaDGAT1基因编码的氨基酸序列进行保守区预测，结果表明(图3)，该蛋白在第81～515位氨基酸序列具有典型的PLN02401结构域，该结构域属于膜结合O-酰基转移酶MBOAT (membrane bound O-acyltransferase)超家族，此结构域包含酰基转移酶，在活性位点上有保守的组氨酸残基，此残基主要用于催化蛋白质上脂肪酸酰基的酯化反应，推测该蛋白与油脂合成有关。除此之外，PaDGAT1基因编码的氨基酸序列(图4)包括保守结构域(basic motif)、酰基辅酶A结合域(acyl-col binding motif)、蔗糖非发酵相关蛋白激酶结构域(sucrose non-fermenting related protein kinase motif)、亮氨酸拉链结构域(leucine zipper motif)、二酰甘油酰基转移酶功能域(DGAT motif)、脂肪酸结合蛋白特征(fatty acid protein signature)、二酰甘油结合域(DAG binding motif)和内质网定位信号(ER-DIR)，其中在亮氨酸拉链结构中存在重要的脯氨酸(Pro)和丝氨酸(Ser)。将牡丹PaDGAT1蛋白与其他植物的DGAT蛋白在NCBI上进行BlastP氨基酸同源比对，发现其与多个物种的DGAT蛋白具有较高的一致性，其中与梅(PrunusmumeXP008242379)、山杏(PrunussibiricaAIX97817)和樱桃(PrunusaviumXP021805031)等植物的DGAT蛋白具有91.77%的一致性，牡丹PaDGAT1蛋白的氨基酸序列在中间区和C端保守性强，而在N端保守性差(图4)。

图3 PaDGAT1基因编码蛋白结构域Fig.3 Domain of the PaDGAT1 protein

XP008242379.梅；AIX97817. 山杏；XP021805031. 樱桃图4 PaDGAT1基因的氨基酸序列与同源序列比对XP008242379. Prunus mume；AIX97817. Prunus sibirica；XP021805031. Prunus aviumFig.4 Alignment of PaDGAT1 amino sequence with other homologous proteins

利用ProtParam 软件分析PaDGAT1基因编码蛋白的理化性质，结果表明，该蛋白的分子量为58.86 kD，理论等电点为8.62，分子式为C2698H4169N695O710S36；负电荷残基总数(Asp+Glu)为39，正电荷残基总数(Arg+Lys)为46。在组成PaDGAT1蛋白的20种氨基酸中，亮氨酸(Leu)所占比例最高(10.8%)，苏氨酸(Thr)所占比例最低(2.3%)。该蛋白的不稳定指数为45.23，脂肪指数为103.63，根据Guruprasad方法判定，PaDGAT1蛋白不稳定。采用ProtScale分析蛋白的亲疏水性，结果显示，PaDGAT1蛋白质属于疏水蛋白，其中第53位的亮氨酸(Leu)亲水性最强(-2.544)，第130位缬氨酸(Val)的疏水性最强(3.689)。通过ExPASy网站上的GOR预测蛋白质二级结构，结果表明，α螺旋(alpha helix)占18.76%，延伸链(extended strand)占33.66%，无规则卷曲(random coil)占47.58%，可见，在整个PaDGAT1蛋白质空间结构中，无规则卷曲和延伸链是其主要的结构元件。

图5 氨基酸序列进化分析Fig.5 Phylogenetic analysis of amino acids sequences

H7、H14、H21、H28分别表示种子收获后第7天、第14天、第21天和第28天;不同小写字母表示0.05水平显著性差异图6 PaDGAT1基因在不同时期和不同组织中的表达H7, H14, H21 and H28 indicated 7, 14, 21 and 28 days after harvest; The different nornal letters mean significant difference at 0.05 levelFig.6 The expression level of PaDGAT1 gene in different stages and tissues

为了进一步分析PaDGAT1基因的系统进化，选取多种植物的DGAT蛋白序列构建系统进化树(图5)，结果表明，不同类型DGAT蛋白差异明显，可以将植物体内的DGAT蛋白分为2大分支，4个亚家族，分别是DGAT1、DGAT2、DGAT3和WS/DGAT亚家族，其中，DGAT1和DGAT2亚家族属于一个分支，DGAT3与WS/DGAT亚家族属于另一个分支，大豆(Glycinemax)、花生(Arachishypogaea)和山杏(Prunussibirica)等共属于DGAT1亚家族，本研究的牡丹PaDGAT1蛋白与油橄榄(Oleaeuropaea)DGAT蛋白亲缘关系最近。

2.3 牡丹DGAT基因的表达分析

为了研究DGAT基因在牡丹生长发育及种子发育过程中的调控作用，采取实时荧光定量PCR法对其进行分析。结果表明，在牡丹的不同组织器官中，PaDGAT1基因表达量具有明显差异，在花芽中表达量最高，在叶、茎和未发育子房中表达量低(图6，A)。在种子发育过程中，PaDGAT1基因的表达量呈现前期不断升高，中期下降，后期又升高的趋势。即从子房发育至28 d时，表达量升至最高，随后表达量下降，在种子发育85 d时收获，其表达量又升高(图6，B)。在种子收获后，PaDGAT1基因的表达水平呈现先升高后降低的趋势，在收获7 d时升至最高，随着种子的干燥和进一步成熟，其表达量逐渐下降(图6，C)。结果分析表明DGAT基因主要参与种子发育和成熟的调控过程。

3 讨 论

本研究从牡丹种子中克隆了1个DGAT基因全长序列，该基因编码蛋白属于膜结合O-酰基转移酶MBOAT超家族成员；进化上与油橄榄的DGAT蛋白亲缘关系最近；表达分析表明，牡丹PaDGAT1基因在花芽中表达量最高，在叶、茎和未发育子房中表达量较低；在种子发育过程中，其表达水平呈现先升高再降低又升高的趋势；在种子收获后的7 d，PaDGAT1基因表达量最高，随着种子的干燥其表达量逐渐降低。

二酰甘油酰基转移酶DGAT是催化三酰甘油TAG合成的最后一步，也是一个处于关键步骤的酶，对于植物种子中的脂肪酸积累及油脂合成的调控具有重要作用，也因而被广泛研究[15]。DGAT基因在控制脂肪酸向TAG的流动方面起着决定性作用，在油料作物及能够积累非常见脂肪酸(unusual FAs)的植物中，DGAT基因的转录水平与油脂的积累量有一定的相关性[11]。本研究牡丹的PaDGAT1蛋白具有多个保守结构域，符合DGAT1蛋白的结构特点[16]，同时包含植物DGAT蛋白已知的功能结构域，其中在亮氨酸拉链结构域(leucine zipper motif)中存在重要的脯氨酸(Pro)和丝氨酸(Ser)残基，保证该特征区域对蛋白的结合起到调节作用[17-19]。有研究表明，在玉米的该结合域中由于脯氨酸残基的缺失使DGAT酶活下降，异位表达带该残基的玉米可使其种子中油含量及油酸含量大量增加[20]，在蒺藜苜蓿的2个DGAT1基因突变株中同样证实脯氨酸残基的存在会影响TAG的合成和油体形成[8]。

研究表明，DGAT1是一个多功能酶，不仅能催化合成三酰甘油TAG，还参与合成二酰甘油、维生素A及蜡质[21]，同样，在大豆和拟南芥中，该酶是油脂积累过程中一种主要酶[11]，研究表明，DGAT1和DGAT2存在远亲的微生物基因(在酵母中除外)，这说明DGAT基因是一个古老的基因家族，在人类和植物的进化之前就已经出现[22-23]。本研究结果显示，牡丹PaDGAT1蛋白属于DGAT1亚家族，其N端保守性差，并与油橄榄(Oleaeuropaea)亲缘关系最近。众所周知，橄榄油是从新鲜油橄榄果实中冷榨提取的一种高档食用植物油，橄榄油作为一种高档食用油，除了富含不饱和脂肪酸外，还含有丰富的生物活性物质如多酚、角鲨烯和维生素等，这些成分具有抗氧化、调节胆固醇、预防癌症、美容及调整人体生理机能的重要作用[24]，这也进一步证明牡丹籽油同样具有较高的营养与保健价值。

大量研究表明，DGAT基因在大多数高等植物中的各个器官中均有表达，对亚麻荠的研究发现，DGAT基因在种子发育时期也有特异性表达[25]。在本研究中，牡丹PaDGAT1基因在花芽中大量表达，而在叶片、茎和未发育子房中低表达，这与拟南芥[5]、油菜[26]和大豆[27]等大多双子植物的组织器官表达模式相似。在种子发育过程中，随着牡丹种子的不断发育成熟，PaDGAT1基因表达量呈现出先升高后降低再升高的趋势，这与紫苏[28]和蓖麻[29]种子DGAT基因具有相似的表达趋势，这说明DGAT基因的表达可能与种子萌发[8]和胚发育[30]有关。研究表明，在种子萌发过程中，脂肪酸的动员与DGAT1基因密切相关，可以促使TAG合成增加，并作为种子发育的主要碳源供应途径[31]。He等[32]证实萌发的蓖麻种子中脂类合成与DGAT1 相关。在牡丹种子收获后，PaDGAT1基因表达量升高，在收获后7 d时，表达量最高，随后迅速下降。由此推测，种子在前期需要积累大量TAG来满足种子萌发和快速生长发育的需求；在牡丹种子收获后，其油分的形成与积累还在进行。这些结果说明PaDGAT1基因调控着牡丹种子发育和成熟中油脂合成的整个过程。

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