辣椒雄性不育系SDH4基因的表达特性分析

邵贵芳，王 姣，张 水，赵 凯，邓明华

(云南农业大学 园林园艺学院，昆明 650201)

细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility, CMS)是发生在自然界的一种普遍现象，目前已在200多个物种中广泛发现[1]。作为杂交育种的重要手段，雄性不育的产生往往与线粒体有着密不可分的关系。线粒体作为植物生长过程的重要产能细胞器，为植物提供90%以上的能量。研究表明，在大多数植物中，线粒体的功能紊乱，造成植物在花粉发育高度需要能量的关键环节因能量供应不足，导致不能产生正常的功能性花粉，从而引起植物的雄性不育[2]。

线粒体呼吸链包含4个复合体：复合体Ⅰ(NADH脱氢酶)、复合体Ⅱ(琥珀酸脱氢酶)、复合体Ⅲ(细胞色素C还原酶)和复合体Ⅳ(细胞色素C氧化酶)。F0F1-ATP合酶被称为复合体Ⅴ，但其并没有电子传递活性。线粒体经过这些复合体进行电子传递，从而构成电化学梯度产生能量，供给植物正常生长。吕俊恒[3]在辣椒雄性不育系9704A和同型保持系9704B的叶片和花蕾的不同时期发现，能量代谢的相关基因G6PDH、MDH、ACO和NDPK，在保持系不同组织、两系花蕾不同时期均有差异表达，认为这几个基因与辣椒植株的生长发育密切相关，它们明显差异的表达量，可能引起能量代谢紊乱，导致植株雄性不育。线粒体复合体是电子传递过程中的关键环节，SDH4作为编码线粒体电子传递链复合体Ⅱ亚基的重要基因，其功能的是否正常直接影响着复合体Ⅰ的生物活性。

RNA编辑是线粒体基因转录后调控表达的一种重要方式，其现象普遍存在于植物、动物、微生物等有机生物体，以及细胞核、线粒体、叶绿体等具有自身遗传编码系统的细胞器中。近年来研究表明，高等植物CMS的发生与RNA编辑有一定的关系。基因转录后通过碱基的插入、缺失或替换，使RNA产物的长度、结构发生变化从而影响基因的表达模式或创造嵌合基因，导致线粒体的功能紊乱，造成胞质雄性不育[4-6]。

本研究通过对SDH4基因在保持系不同组织及两系中花蕾不同发育时期的表达分析，以及在两系中转录本编辑位点的分析，以期找到SDH4基因在两系中差异，为进一步研究辣椒雄性不育的形成与能量代谢的关系提供参考。

1 材料和方法

1.1 材 料

辣椒雄性不育系9704A及其保持系9704B，种植于云南农业大学园林园艺学院实验基地，取保持系茎、叶、花、果实、胎座和种子6个不同组织作为组织表达材料；取不育系与保持系造孢细胞增殖期、花粉母细胞减数分裂期、小孢子单核期和小孢子成熟期4个不同时期花蕾，作为研究两系表达谱差异的材料。所有材料取样后立即冻于液氮，置于-80 ℃超低温冰箱长期保存备用。

1.2 方 法

1.2.1DNA和RNA提取及cDNA合成本实验通过BioTeKe公司的试剂盒提取DNA,用Trizol试剂对各个组织与花蕾不同时期的RNA进行提取，提取后立即用紫外分光光度仪和1%琼脂糖凝胶电泳双重检测RNA浓度及纯度，检测合格后使用TaKaRa公司的反转录试剂盒进行cDNA合成。

1.2.2SDH4基因的克隆根据辣椒物种中提供的该基因的编码序列，利用Primer Premier 5.0设计引物F1(AAACGACCAGGTACAGCATA)和R1(GTCATCTGACCAAGGAGCAT)，引物序列由北京擎科新业生物技术有限公司合成。分别以不育系和保持系的DNA和cDNA为模板，进行PCR扩增。反应条件为：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，40个循环；72 ℃后延伸10 min；4 ℃保存。

1.2.3生物信息学分析利用GenScan (http: //genes. mit. edu /GENSCAN.html) 预测基因的cDNA 序列，利用DNAMAN，Editseq，seqman等软件对测序结果进行初步编辑、比对、人工校对，并推导出氨基酸序列，氨基酸分子量(Mw) 和等电点(pI)利用Compute pI /Mw Tool (http: //us. expasy. org /tools /pi_tool. html) 来预测，利用SignalP 4. 1 server(http: //www. cbs. dtu. dk /services /SignalP) 预测信号肽序列，使用PSort Ⅱ 程序(http: //psort. hgc. jp) 预测蛋白质的亚细胞定位情况，蛋白质的保守结构域通过NCBI (http: //www.ncbi. nlm. nih. gov) 服务器上的Conserved Domain Architecture Retrieval Tool (CDART) 工具(http://www. ncbi. nlm. nih. gov /BLAST) 进行预测，使用SOPMA 程序(http: //npsa-pbil. ibcp. fr)预测蛋白质的二级结构，蛋白质的跨膜螺旋结构由TMHMM Server version 2. 0 程序(http: //www. cbs. dtu. dk /services /TMHMM) 预测。利用ClustalX对氨基酸序列进行同源性比较，并用MEGA7构建多物种系统进化树。

1.2.4实时荧光定量PCR(qRT-PCR) 实时定量PCR采用TaKaRa公司荧光定量试剂盒，染料为SYBR Green，在Applied Biosystem荧光定量PCR仪上进行。以辣椒Actin片段为内标，所用Actin引物为F2(TGCAGGAATCCACGAGACTAC)和 R2(TACCACCACTGAGCACAATGTT)； cDNA为模板，根据SDH4基因的测序结果设计荧光定量引物F3(TCAGAAAAGAAACGAGAG)和R3(GCACATAAATGAAGGGAT)。qRT-PCR反应体系为20 μL体系，包含10 μL SYBR Premix ExTaqⅡ(购于TaKaRa公司)，10 μmol·L-1上下游引物各0.8 μL，2 μL cDNA模板，0.4 μL ROX Reference Dye Ⅱ,6 μL ddH2O；反应程序为：95℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s,循环40次。每个样品设3次重复。反应结束，利用2-ΔΔCt法进行相对表达量分析。

1.2.5SDH4的转录本分析选取两系叶片为材料，分别提取DNA和RNA进行SDH4基因扩增，扩增产物送北京擎科新业生物技术有限公司测序,然后比对分析。

2 结果与分析

2.1 SDH4基因的分离

分别以辣椒雄性不育系与保持系的DNA和cDNA为模板，采用特异性引物进行SDH4基因PCR扩增。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增结果送北京擎科新业生物技术有限公司测序，结果表明目的片段为450 bp的完全编码序列，与预期结果相符(图1)。

2.2 辣椒SDH4基因的生物信息学分析

RT-PCR产物测序结果表明，编码区全长378 bp,编码125个氨基酸(图2)。生物信息学分析表明SDH4蛋白质等电点为10.163，分子量为 14 532.54 ku，无信号肽，亚细胞定位显示该蛋白质位于细胞质的概率是21.7%。通过SOPMA程序预测SDH4蛋白的二级结构中含有72 aa的α-螺旋(57.60%)，12 aa的延伸链结构(9.60%)，无β转角，40 aa的无规则卷曲(32%)。

2.3 SDH4氨基酸序列比对及其分子进化关系

对雄性不育系与保持系PCR产物的测序结果进行比对，雄性不育系与保持系中SDH4的氨基酸序列无差异。通过Blast(protein)比对可知，辣椒SDH4氨基酸序列与多个物种SDH4氨基酸序列的相似性分别为：烟草(YP-173457.1)99%，葡萄(YP-002608381.1)93%，酸枣(YP-009241655.1)94%，西瓜(YP-003587239.1)92%，番木瓜(YP-002608211.1)95%，黄瓜(YP-004849351.1)86%，茄子(AK77854.1)96%，林烟草(XP-009778651.1)100%等。利用MegAlin计算辣椒与其他物种的氨基酸序列的相似度，MEGA7.0构建系统进化树，表明辣椒的SDH4基因与林烟草和烟草的亲缘关系较近(图3和4)。

2.4 SDH4基因的组织表达分析

实时荧光定量结果(图5)表明，SDH4基因在保持系的6个组织中均有表达，但不同组织中表达差异较为明显。其中，SDH4基因在种子中的表达量最多，为茎中表达量的50倍；叶、果皮、胎座的表达量相差很小，花中的表达量仅高于茎，叶、果皮、胎座的表达量分别是花中表达量的3.8、3.0和2.0倍。

M．DL2000；A. 9704A；B. 9704B图1 辣椒SDH4基因扩增结果Fig.1 The amplification result of SDH4 gene in pepper

*代表终止密码子图2 辣椒SDH4基因的 CDS序列及其编码的氨基酸序列* indicates the stop codonFig.2 The coding region sequence and amino acid sequence of SDH4

2.5 SDH4基因在不育系和保持系不同花期的表达

实时荧光定量结果(图6)表明，在小孢子发育的造孢细胞增殖期、花粉母细胞减数分裂期和小孢子成熟期，SDH4基因在不育系和保持系的表达量差异不大，但在花粉母细胞减数分裂时期，SDH4的表达量明显高于保持系。对于不育系，SDH4基因的表达在花粉母细胞减数分裂时期最低；保持系中，则在造孢细胞增殖期最低，随后呈现上升趋势，在小孢子成熟期突然骤降。不管是不育系还是保持系，SDH4基因的表达量均在小孢子单核期达到最高，而在小孢子成熟期表达量降低。此结果表明SDH4基因在不育系和保持系中的表达存在差异，该差异可能与雄性不育的形成有关。

2.6 SDH4基因转录本的编辑位点

RNA编辑指DNA转录RNA后，核苷酸在RNA上的插入、缺失或碱基替换来改变DNA来源模板遗传信息的普遍现象，对中心法则进行了新的重要补充[7]。在高等植物中,RNA的编辑一般发生在编码区，且一般是C→U。当然，也会通过对基因组编码的C残基进行脱氨基来创造终止密码子[4]。研究表明，RNA编辑与植物的细胞性雄性不育的发生有一定的关系。

图3 辣椒与其他物种SDH4基因推导的氨基酸比对Fig.3 Alignment of deduced amino acid sequences of SDH4 from pepper and other plants

在辣椒不育系和保持系中，SDH4都有且只有一处编辑位点，在29位点上编辑方式为C→T(图7中箭头),位于密码子的第2位，导致氨基酸由丝氨酸变为亮氨酸，由亲水性氨基酸变为疏水性氨基酸，增强了蛋白质结构的疏水性能。推测不育的形成可能与氨基酸的亲疏水性有关。

3 讨 论

琥珀酸脱氢酶复合物(复合体Ⅱ)是一种存在于线粒体的高度保守的蛋白质复合物，由SDH1到醌结合位点[8],通过跨膜螺旋结构将复合体锚定在线粒体内膜上。最新研究发现，在拟南芥中，SDH6和SDH7(SDH3和SDH4的缺失序列)有助于将琥珀酸脱氢酶锚定在线粒体内膜上[9]。SDH4活性指标对雄性生殖细胞具有重要的指导意义[10-11]。在一些作物中，研究者通过酶细胞化学分析发现，不育系和保持系的SDH活性存在差异，推测可能与雄性不育的形成有关[12-16]。

标尺代表遗传距离；数值代表从1 000次重复计算得到的Bootstrap百分比值图4 辣椒与其他物种SDH4基因推导氨基酸序列进化树分析The scale bar represents genetic distance; Number represents the Bootstrap percentage value calculated from 1 000 replicatesFig.4 The evolutionary tree of amino acid sequences of SDH4 from pepper and other plants

图中数据为3次重复的平均值±SD；*和**分别代表在0.05和0.01水平差异显著性。图6同图5 SDH4基因在9704B不同组织中的表达The data of each column in mean±SD (n=3);* indicates significance at 0.05 level;* * indicate significance at 0.01 level. The same as Fig.6Fig.5 The expression of SDH4 gene in different organs of the maintainer line 9704B

SDH4亚基形成，属于琥珀酸泛醌氧化还原酶家族。但在目前，有研究发现植物复合体Ⅱ中出现了4个其他以外的亚基(成为SDH5～SDH8)。SDH4是位于线粒体电子传递复合体Ⅱ的关键酶，关系着ATP的产生和生物合成过程碳骨架的形成。SDH4编码跨膜亚基，跨膜亚基含有血红素和同一个基因在植物的不同组织中会根据自身的特性与功能进行时空的特异性表达。这也是造成在同一植株不同组织表达差异的原因。SDH4作为电子传递链过程的关键酶，与ATP的产生有着一定的联系。一般情况下，年幼的、生长旺盛的器官的呼吸速率高于年老的、衰老的器官；生殖器官(花、果、种子)高于营养器官(茎、叶)。在9704B的6个组织中，SDH4在种子中的表达量最高，很有可能采取材料的时候正好是种子形成期，该时期的种子需要大量能量及淀粉、蛋白等有机物质来用于细胞增大，促进胚、胚乳或子叶的快速生长。实验材料选取的叶片可能是新鲜的嫩叶。在不育系和保持系的花期的第2时期(花粉母细胞减数分裂时期)，保持系中的SDH4基因的表达量高于不育系，但在小孢子单核期，不育系中SDH4表达量骤然上升，且表达量高于保持系。有研究表明，不育系的小孢子在四分体时期会出现异常，到单核期初期，小孢子空瘪，并开始解体；到中后期，小孢子质核及小孢子壁都开始逐渐降解。从小孢子单核期到小孢子成熟期，SDH4基因在不育系中的表达均高于保持系。我们推测，不育因子导致的线粒体功能紊乱，在小孢子正常发育的关键时期，影响了能量的正常供应，从而导致了雄性不育的发生。

1.造孢细胞增殖期；2.花粉母细胞减数分裂期；3.小孢子单核期；4.小孢子成熟期图6 SDH4基因在9704A和9704B花蕾不同发育时期的表达1. Pporogenous celldivision stage; 2. Pollen mother cell (PMC) meiosis stage; 3. Uninucleate microspore stage; 4. Mature pollen stageFig.6 The expression of SDH4 gene during the 4 flower development stages in 9704A and 9704B

图7 SDH4基因在辣椒不育系和保持系中转录本的编辑位点Fig.7 Editing sites in transcript of SDH4 gene in pepper sterile and maintainer line

RNA的正常编辑对线粒体的正常功能发挥着重要的作用，当线粒体基因发生不正确或不完全的RNA编辑时，其产物可能导致线粒体功能的异常而造成雄性不育[17]。SDH4基因在不育系和保持系中的编辑位点无变化，为完全编辑，但编辑频率是否会有差异，从而影响ATP合酶的正常功能，还有待进一步的研究。

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