妊娠小鼠子宫内注射影响因素的研究*

★ 陈来 李俊 殷玉婷 陈丽玲 袁可望 舒坤 罗小泉 徐彭 李姗姗

(江西中医药大学 南昌 330004)

现有用于新药临床前体内药效学研究的肿瘤动物模型因与人肿瘤实际情况差异较大，导致动物实验结果与临床治疗人肿瘤的实际情况相差较远情况较为常见。如能建立与人肿瘤实际情况差异小，且免疫功能相对正常的人肿瘤异种移植动物模型的可能性，则可提高抗癌新药和新疗法的筛选效率。基于子宫内移植供体细胞，可成功地诱导特异性免疫耐受并维持嵌合体状态的原理，我们试图探讨在胚胎时期子宫内注射人源肿瘤细胞，建立不会影响模型动物免疫系统对其它免疫活性物质免疫反应的，独能允许具有相同抗原特异性的人肿瘤移植物正常生长的异种移植肿瘤动物模型成的可能性。昆明小鼠由于繁殖周期短、多胎妊娠和抵抗力强，是以昆明小鼠为实验对象。本文以昆明小鼠为实验对象，探讨了注射天数、孕鼠经初产等因素对胎鼠成活率的影响，初步确定了模型建立中子宫移植部分的关键因素。

1 材料

1.1 实验动物 昆明种小鼠，SPF级，体质量18 ～ 22 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，合格证号为JZDWNo：43004700007670。所有动物实验均遵循国家相关标准及实验动物护理和使用指南进行。

1.2 药品 戊巴比妥钠(批号为922L035)，购自Pentobarbital sodium公司；盐酸布比卡因(批号为D1102A)，购自大连美仑生物技术有限公司。

1.3 主要试剂 甲醛(批号为1307132)，购自西陇化工股份有限公司；PBS(批号为20141215)，购自北京索莱宝科技有限公司。

1.4 主要仪器 拉制仪(型号为PC-1)，购自日本成茂公司；微量注射器(型号为IM-9B)，购自日本成茂公司；恒温台(型号为TP-SMZSL)，购自日本东海希多公司。

2 方法

2.1 微量注射针的制备 用外径1mm的毛细玻璃管拉制璃微量注射针头，通过调整拉制仪的熔点温度及拉制重量，使得拉制完成的针头部分从锥形的开始到针尖的距离约为1cm (见图1A)。

2.2 实验动物分组与手术 选取雄性种鼠和初产或经产的雌性种鼠，在交配前分开隔离饲养。下午1∶1合笼，第2d检查阴栓，发现阴栓当天定为0d。初产或经产的孕鼠各选取40只，随机分为4组，分别于孕14d、15d、16d开腹腔行子宫内注射，即向胎鼠腹腔注射20μL的无菌PBS溶液，全部胎鼠注射完成后缝合。假手术组孕鼠于孕15d进行实验，但只开腹腔不进行胎鼠腹腔注射，直接缝合。每组孕鼠数量为10只，如发生麻醉致死的情况，则补足。

手术具体方法如下：孕鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠溶液(70mg/kg)。当孕鼠麻醉时，准备好注射物，将制备好的玻璃微量注射针头组装到微量注射器上。确认麻醉好后，将孕鼠放在恒温台上，仰卧，固定。腹部用75%酒精消毒并润湿，使用双面刀片剃光腹部毛发。下腹部做1cm的纵向切口(见图1B)。用湿润棉签轻轻舒展筋膜，并将妊娠子宫从切口中牵出，确定左、右卵巢，记录胎鼠数量(见图1C)后将子宫放回腹腔，以使胎鼠保持温暖。其后逐只牵出进行注射，术中不断用37°C预热PBS湿润子宫。记录胎鼠注射可能出现的出血、囊液渗出、囊膜外突、胎鼠损伤等手术并发症。

注射时用拇指和食指固定胎鼠，确定胎鼠腹腔位置后将注射针头依次穿过子宫，羊膜和胎鼠皮肤，进入胎鼠腹腔，每个胎鼠注射20μL PBS(见图1D)。注射完成后，小心抽离注射针，将胎鼠小心放回腹腔。用5-0编织可吸收缝线缝合筋膜，5-0不可吸收缝线缝合皮肤(见图1E)。于切口处皮下注射0.025%盐酸布比卡因溶液(5mg/kg)以减少孕鼠痛苦。将孕鼠放置在保温台上保持体温，直至其醒来。醒来后转移至铺了厚纱布的笼具里，并置于安静的区域直到生产。

第二天检查孕鼠有无阴道出血、腹部收缩或烦躁等流产征兆。其后每天观察，注意伤口红肿、发炎、伤口分离和感染等症状。记录每组孕鼠分娩及胎鼠成活及体重情况。

2.3 统计学分析 实验数据以平均值±标准误表示，用SPSS17.0 软件包分析，组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)评价整体性差异，并进行方差齐性检验。采用χ2检验、t检验进行统计学分析。P<0.05表示有显著性差异。

3 结果与分析

3.1 手术并发症 3只孕鼠因手术麻醉过量死亡(初产1假手术组、初产16d注射组和经产16d注射组各1只)，初产孕鼠手术时妊娠胎鼠数量为6～18只，经产孕鼠为8～20只(见表1)。

除假手术组外，各组均有出血、囊液渗出、囊膜外突、胎鼠损伤等手术并发症，各组并发症与假手术组相比有显著性差异(P<0.01)；初产和经产各注射时间点组之间，以及相同注射时间的初产和经产组之间无显著性差异(见表1)。

3.2 妊娠结局 因正常昆明小鼠生产在孕18～20d之间，故将生产天数少于18d孕鼠认定为早产孕鼠。共有3只因难产死亡(初产14d注射组、初产15d注射组和经产14d注射组各1只)，较初产孕鼠相比，经产孕鼠出现难产死亡的情况有所减少(见表2)。

各注射组的胚胎丢失率较假手术组低，具有显著性差异(P<0.01)。初产孕鼠各注射组间的胚胎丢失率无显著差异，但相同注射时间的初产孕鼠的胚胎丢失率较经产组低，并且孕14d注射的经产组和初产组间有显著性差异(P<0.05)(见表2)。

4 讨论

Burnet提出，体内存在为数众多具有免疫活性的细胞克隆，每一个克隆细胞都具有其特异的、能与其相应抗原决定簇起反应的受体。在胚胎时期体细胞突变频繁，体内已具有针对多种抗原的、众多特异性淋巴细胞克隆，此时若与某种自身的或人工导入的抗原相遇，与其相应的淋巴细胞克隆即被破坏或抑制，出生后即对胚胎期曾接触过的抗原形成耐受，即获得性免疫耐受，而对胚胎时期从未接触过的抗原仍产生免疫应答。研究表明，采用子宫内注射异体、甚至异种细胞的方法，可成功地诱导免疫耐受[1-2]并在移植排斥研究领域得到广泛应用[3]。且子宫内注射诱导移植耐受还具有所需外源性细胞相对较少、母体内环境可防止微生物侵袭等优点。据此我们认为：采用人源细胞进行子宫内注射预处理，诱导胎鼠对人肿瘤抗原产生特异性免疫耐受，即让胎鼠的免疫系统将人肿瘤抗原认为是自身抗原，则出生后的小鼠会将具有相同抗原特异性的人肿瘤细胞认为是自身的组织细胞，使之顺利在其体内成瘤，同时不会影响自身免疫系统对其它免疫活性物质的免疫反应，从而解决正常动物对异种肿瘤的免疫排斥难题。

注:A： 微量注射针的制备；B：下腹部做纵向切口；C：用棉签将妊娠子宫从切口中牵出，确保看到所有胎鼠；D：胎鼠腹腔注射；E：缝合筋膜及皮肤

图1 子宫内注射关键步骤

注:与假手术组比较，**P<0.01。

表2 各组孕鼠妊娠结局的比较(n=10)

存活乳鼠数(%)与假手术组比较，**P<0.01；存活乳鼠数(%)与初产孕鼠孕14天注射组比较，§P<0.05。

基于上述观点或假定，我们拟建立昆明小鼠子宫内注射方法。在注射部位的选择上，我们采用了胎鼠腹腔注射。刘英等[4]采用胎鼠腹腔注射成功地建立了人脐血造血干细胞宫内移植的小鼠模型，其推测宿主腹腔的间皮细胞可提供支架基质作用，使腹腔如同一个造血干细胞库，不断地把造血干细胞输送到血循环。该原理同样适用模型建立中拟注射的人肿瘤细胞。在注射时间的选择上，考虑到过早注射对胎鼠的损伤较大，而越晚注射则诱导的免疫耐受效果越差，因此在保证胎鼠存活率的前提下尽量提前注射时间，确定注射时间范围在孕14～16d之间，本实验确定了该时间范围，注射操作对胎鼠存活率无明显影响，可作为后续研究优化胎鼠腹腔注射时间的选取范围。在孕鼠选择上，实验结果表明孕14d注射组经产孕鼠较初产孕鼠的胎鼠成活率明显增加，难产死亡的数量也有所减少，可能经产孕鼠的生育耐受性、适应性和经验上都优于初产孕鼠，因此采用经产孕鼠可显著提高子宫内注射后胎鼠存活率，后续研究将采用经产孕鼠。

在子宫内注射后出现的流产和早产与操作技术密切相关，主要是术中对胚胎操作的过度压迫、子宫复位不佳和手术时间过长造成的。为减少并发症的发生，我们采取了以下措施：①采用玻璃毛细胞拉制针头，使进针损伤降至最低，羊水不易漏出。②进针时尽量避开血管和胎盘，动作轻柔，以减少出血的发生。③经胎鼠腹腔途径时，调整胎鼠位置，使其充分暴露腹部后再进针，以减少对胎鼠的损伤。④术后给与镇痛药，减少孕鼠的不适。⑤整个手术过程严格无菌操作，加强术后的保暖和护理措施。实验操作技术的提高和熟练可明显降低流产、早产和机械性损伤的发生。

通过以上实验，我们确认了后续研究中的关键因素，优化、改进了操作技术，有助于研究的顺利进行。

[1]Jeng Chang Chen, Liang Shi Ou, Hsiu Yueh Yu, et al. Allogeneic lymphocytes exerted graft-versus-host rather than tolerogenic effects on preimmune fetuses[J].J Surg Res, 2013, 183(1): 405-411.

[2]Kristin L MacArthur, Catherine H Wu, George Y Wu. Animal models for the study of hepatitis C virus infection and replication[J].World J Gastroenterol, 2012, 18(23): 2 909-2 913.

[3]Jeng Chang Chen, Ming Ling Kuo, Liang Shiou Ou, et al. Characterization of tolerance induction through prenatal marrow transplantation: the requirement for a threshold level of chimerism to establish rather than maintain postnatal skin tolerance[J].Cell Transplant, 2010, 19(12): 1 609-1 622.

[4]刘英，庄广伦，游泽山，等. 经胎鼠腹腔途径进行人脐血造血干细胞宫内移植的实验[J].中山医科大学学报，2001，22(1)：22-24, 28.