维甲酸诱导BALB/c近交系小鼠腭裂动物模型的实验研究

拜薛鹏，南欣荣，闫星泉，刘典伟

(山西医科大学第一临床医院口腔颌面外科，太原 030001;*通讯作者，E-mail:xr_nan@sina.com)

先天性腭裂是一种多基因遗传病，其发病机制不清楚，现多数学者认为是基因和环境联合作用引起，所以腭裂发病机制的研究有助于腭裂的预防和产前诊断。通过对一些化学药物产生腭裂的研究，已能初步指出维生素A族缺乏或过量均可导致腭裂发生率增高［1，2］，其中 RA 是致畸作用最强的一种。本研究拟通过研究在特定妊娠期给予BALB/c近交系小鼠腭裂模型所需维甲酸(retinoic acid，RA)的最佳剂量，为之后研究致畸分子机制提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 试剂

RA(Sigma公司)于－20℃冰箱内避光保存备用。使用时取出，在避光条件下溶于相应容量的玉米油(100 mg RA溶于10 ml玉米油，RA为10 mg/ml)，将其震荡混匀，立即管饲孕鼠。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠饲养 选取9周龄BALB/c近交系小鼠(山西医科大学实验动物中心提供)，体重20－25 g，饲养在(25±2)℃和人工调控12 h昼夜循环条件下，任意给予食物和水。将未交配生育过的雌雄小鼠于第1天下午6:00雌雄3:1合笼交配，第2天上午8:00查看阴栓，有阴栓者定为妊娠(gestation day，GD)0 d，标记并称体重，取出单独饲养。GD8 d时称重见阴栓的雌鼠，体重增加小于2.0 g者判定为假孕，取出重新交配，体重增加大于或等于2.0 g者判定为受孕，用于实验。

1.2.2 分组及给药 将孕鼠36只，随机分为实验组和对照组，实验组:共30只，分为5个组，每组6只，其中三组分别在 GD8 d，GD10 d，GD12 d，上午8:00一次性管饲RA玉米油悬液，剂量均为50 mg/kg，其余两组则于GD10d上午8:00一次性管饲RA玉米油悬液，剂量分别为40 mg/kg和60 mg/kg;另设对照组:共6只，按给药时间分为3组，每组各2只小鼠，分别于 GD8 d，GD10 d，GD12 d上午8:00一次性管饲与实验组等剂量的玉米油。

1.3 胎鼠致畸形及毒性的检测

记录胎鼠总数、腭裂胎鼠数、每窝胎鼠平均体重。以腭裂比率来评估RA诱导胎鼠腭裂畸形的情况，以胎鼠平均体重评估RA对胎鼠的毒性作用。

1.4 标本的制备与染色

GD17 d处死全部孕鼠，剖腹取出胎鼠，观察胎鼠的畸形情况。计算每个胚胎的体重。在体视显微镜下应用显微外科器械剪取腭突。并将部分实验组和对照组胎鼠的鼠头脱水、浸蜡、包埋、切片，切片以麦克尔软骨为基准面，作冠状位约5μm连续切片，HE染色。观察胎鼠两侧腭突融合情况。

1.5 统计学分析

采用SPSS18.0统计软件对胎鼠体重变化进行方差分析。对胚胎腭裂发生情况进行χ2检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胎鼠体重变化分析

GD10 d RA处理孕鼠，50 mg/kg RA及60 mg/kg RA实验组胎鼠均重与对照组(0 mg/kg)胎鼠均重之间差异有统计学意义(P＜0.05，见表1)，而40 mg/kg RA实验组胎鼠均重与对照组胎鼠均重比较差异无统计学意义(P=0.181)，50 mg/kg与60 mg/kg RA实验组胎鼠均重比较差异均无统计学意义(P＞0.05);其余各实验组胎鼠均重之间差异有显著性(P＜0.05)。50 mg/kg RA对BALB/c近交系小鼠有较强的毒性作用。

GD8d实验组胎鼠均重与对照组胎鼠均重之间差异有统计学意义(P＜0.05，见表2)，GD10 d实验组与对照组胎鼠均重之间差异有统计学意义(P＜0.05)，而GD12 d实验组与对照组胎鼠均重之间差异无统计学意义(P＞0.05);50 mg/kg RA处理孕鼠，GD8 d、GD10 d和GD12 d胎鼠均重之间差异有统计学意义(F=73.075，P＜0.05，见表2)。GD8 d和GD10d是诱发BALB/c小鼠畸形的敏感时期。

表1 妊娠10 d胎鼠体重分布(±s)Table 1 The weight of GD10 d embryos after exposed to different doses of RA(±s)

表1 妊娠10 d胎鼠体重分布(±s)Table 1 The weight of GD10 d embryos after exposed to different doses of RA(±s)

?

与0mg/kg比较，*P＜0.05;与40mg/kg比较，#P＜0.05

表2 不同给药时间对各组胎鼠体重的影响(±s)Table 2 The weight of embryo in each group at different feeding time(±s)

表2 不同给药时间对各组胎鼠体重的影响(±s)Table 2 The weight of embryo in each group at different feeding time(±s)

与0mg/kg比较，*P＜0.05

?

2.2 胚鼠腭裂发生情况

表3结果显示:50 mg/kg RA剂量组腭裂发生率为93.75%，40 mg/kg与60 mg/kg剂量组腭裂发生率都为0.00%，故认定剂量50 mg/kg RA为诱导腭裂畸形发生最佳用药剂量(P＜0.05)。其中GD8 d和GD12 d给药腭裂的发生率分别为36.00% 和45.83%，而GD10 d给药腭裂的发生率最高(P＜0.05)，故认定GD10 d为RA诱导BALB/c小鼠腭裂畸形发生的最佳用药时间。

表3 不同处理条件下各组胎鼠腭裂发生情况Table 3 The incidence of cleft palate after exposed to different doses of RA at different time

2.3 胎鼠腭裂的形态学观察

2.3.1 肉眼观察 肉眼观察胎鼠腭裂模型，可见胎鼠腭部正中有边缘不太规整的裂隙，其长度一般为1.2－2.6cm，最宽处有0.8 cm(见图1)。

图1 体视镜下观察胎鼠腭裂畸形发生情况 (×4)Figure 1 Observation of cleft palate under stereoscope (×4)

图2 HE染色观察胎鼠两侧腭突细胞发生融合情况 (HE，×40)Figure 2 Morphology of both sides of palatal cells in mice at GD17 d (HE，×40)

2.3.2 光镜观察 HE染色显示:GD17d对照组胎鼠两侧腭突上抬至舌体完全接触融合，腭突细胞相互连接贯通形成完整的腭板;GD17 d腭裂组胎鼠绝大多数两侧腭突小但能上抬至正常水平并向水平方向生长，体积较小，不能在中线处相互接触形成腭融合板(图2，见第81页)。

3 讨论

先天性腭裂动物模型主要用于腭裂病因学和发生机制方面的研究，目前多用地塞米松、氢化可的松和全反式维甲酸等药物诱导腭裂动物模型，而全反式维甲酸被认为是近年来致畸研究中的一种具有较强的致畸作用的化学药物，主要通过结合维A酸受体调节下游靶基因表达来实现其生物学效应［3，4］。

在小鼠怀孕不同时间即孕8，10，12 d给予一定剂量的维甲酸均能诱发腭裂。Kochhar等［5］认为GD8 d抑制神经嵴细胞的正常迁移，使腭突缺少足够的起源细胞而导致发育不足，形成腭裂。Harris等［6］认为，GD10 d抑制了腭突间充质细胞的增殖，并影响了中嵴上皮的转归而导致腭裂。而在GD12 d并不抑制腭间充质细胞的增殖，而是干扰了腭的上抬、腭中嵴上皮细胞的分化以及腭的粘连融合等过程形成腭裂。吕宝辉等［7］以RA为致畸物，诱发C57BL近交系小鼠腭裂，成功建立了腭裂动物模型，其结果显示:GD10 d为最佳致畸时间，100 mg/kg RA为最佳致畸量。Reynolds等［8］对GD10 d的Swiss Webster小鼠一次性管饲50 mg/kg RA诱导出100%腭裂小鼠模型。然而，我们所做预实验得出:当RA剂量为100 mg/kg对BALB/c近交系小鼠是致死剂量，最终确定50 mg/kg RA对BALB/c近交系小鼠有较高的致畸率。

本实验中，在BALB/c近交系小鼠GD10 d管饲50 mg/kg RA诱导胎鼠腭裂畸形在93%以上。大体畸形除腭裂外，主要畸形为短前肢，偶见有短尾发生。因此，GD10 d，一次性管饲 RA 50 mg/kg，是BALB/c近交系小鼠腭裂形成的理想动物模型。

综上所述，本次实验建模基本成功，成功诱导了胎鼠腭裂，为后续腭裂形成原因及分子机制的研究提供理想动物模型。

［1］Johansen AM，Lie RT，Wilcox AJ，etal.Maternal Dietary Intake of Vitamin A and Risk of Orofacial Clefts:A Populationbased Case-Control Study in Norway［J］.Am J Epidemiol，2008，167(10):1164－280.

［2］Song HM，Nacamuli RP，Xia W，etal.High-dose retinoic acid modulates rat calvarial osteoblast biology［J］.J Cell Physiol，2005，202(1):255－262.

［3］Kitamura M，Ishikawa Y，Moreno-Manzano V，etal.Intervention by retinoic acid in oxidative stress-induced apoptosis［J］.Nephrol Dial Transplant，2002，17(Suppl 9):84－87.

［4］Xu Q，Konta T，Kitanmra M.Retinoic acid regulation of mesangial cell apoptosis［J］.Exp Nephml，2002，10(3):171－175.

［5］Kochhar DM，Jihnson EM.Morphological and autoradiographic studies of cleft palate induced in rat embryos by maternal hypervitaminosis A［J］.J Embryos Exp Morphol，1965，14(3):223－238.

［6］Abbott BD，Harris MW，Bimbaum LS，etal.Etiology of retinoic acid-induced cleft palate varies with the embryonic stage［J］.Teratology，1989，40(6):533－553.

［7］吕宝辉，黄洪章.RA诱导小鼠腭裂动物模型的实验研究［J］.口腔医学研究，2002，18(4):248－250.

［8］Reynolds PR，Schaalje GB，Seegmiller RE.Combination therapy with folic acid and methionine in the prevention of retinoic acid-induced cleft palate in mice［J］.Birth Defects Res Part A Clin Mol Teratol，2003，67(3):168－173.