大叶当归中阿魏酸的提取工艺优化研究

★ 王艳

(新县人民医院 河南 新县 465550)

大叶当归(A.megaphylla)是伞形科植物当归Angelica sinensis(Oliv.) Diels的一种,药用部位为根。广泛分布在三峡库区的巴东、巫溪、石柱和巫山等地。在当地民间常用作当归的代用品。含有与正品当归相同的阿魏酸、藁本内酯、挥发油等活性成分[3-4]。现代药理研究表明,阿魏酸有抗心肌缺血、缺糖、缺氧，抗血栓,抑制血小板聚集等药理作用[1-2]。阿魏酸的提取方法报道很多，传统提取方法耗时较长、操作麻烦、提取效率低；微波辅助提取法、超临界CO2萃取等提取法方法虽能缩短时间，但因设备成本较高，操作麻烦，在实际生产中应用较少。近几年来闪式提取在中药有效成分提取方面潜力巨大，发展迅速，其主要特点是高效节能、操作简便、节约时间、经济实用、提取温度低，且适应范围广，对有效成分的破坏小，响应面设计闪式提取法阿魏酸的研究未见文献报道。

1 仪器与试药

LG16-W高速微量离心机(上海医学医用仪器厂)；Agilent 1100 系列高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；超纯水器(无锡医用仪器公司)；SB3200-超声波提取器(上海能信超声有限公司)；751型可见分光光度计 (上海棱光技术有限公司 )；大叶当归采自巫溪大宁河畔1500米高山上，由三峡中药研究所付绍智教授鉴定。阿魏酸(20100516)；甲醇、乙腈均为色谱纯，其余所用试剂均为分析纯。

2 响应面分析闪式提取法

本研究选取影响闪式提取工艺的三个因素，即提取液乙醇浓度(A)，物料和提取液比(B)，提取时间(C)作为考察因素，每个因素设计为三个水平。

2.1 响应面试验各个因素水平的确定 本研究选取提取溶液浓度，提取时间及料液比三个因素对阿魏酸提取率进行考察，依次对单因素进行考察，以确定每个因素的水平。阿魏酸为一类极性较大的有机化合物，一般提取采用不同浓度的乙醇溶液，本研究采用80%，70%，60%,50%浓度的乙醇溶液，每个浓度平行6次试验，依据阿魏酸的测定方法，结果发现在乙醇浓度为70%时，阿魏酸含量较高，因此选择60%，70%，80%作为乙醇浓度的三个水平。同理采用同样的方法，确定料液比和提取时间的水平。

2.2 响应面分析法因素的选取及方案分析[11]分别称取当归样品 100g,依据 Box-Benhnken中心组合设计原理,同时考虑单因素试验的结果 ,选取乙醇浓度、提取时间、料水比3个因素,自变量的低、 中、 高水平分别以- 1、0、 1 编码 ,以阿魏酸提取率作为响应值 (R)。采用DESIGN-EXPERT对实验结果进行回归分析。试验因素与水平见表1,试验方案及结果见表2。

表1 因素水平表

表2 大叶当归提取工艺响应面表及结果(%)

3 试验结果分析

采用 DESIGN-EXPERT软件对表 3中不同试验条件下得到的阿魏酸收率进行响应面回归分析 ,得拟合方程:

R1 = 6.33667+0.21125A+0.505000B+0.76875C-0.027500AB+0.13000AC+0.047500BC -0.12083A2+0.041667B2-0.37583C2方差分析结果，方差分析结果见表3。

表3 方差分析表

由表3可知,在置信区间 95%,回归方程线性相关系数 R2= 0.9875，回归方程具有统计学意义 , 真实、可靠 。可用作实验点对实验结果进行分析。方程各变异源方差分析表明 ,拟合方程的一次项B/C,即乙醇浓度和提取时间对阿魏酸的提取率有显著影响，而A因素即料液比对阿魏酸的提取率无显著影响。AB/AC/BC交互项和A2/B2/C2二次项无显著性影响。根据回归分析结果作出曲面图 ,见图 1～3。利用DESIGN-EXPERT软件 ,进行分析计算 ,得阿魏酸闪式提取工艺最佳条件为: 提取时间1.18min,料液比 9∶100，乙醇浓度70%,阿魏酸的理论得率为7.163。根据在实际工作中的需要和统计分析的结果，选取乙醇浓度为70%，提取时间1min,料液比1∶12为实际工作时的工艺参数。

4 验证实验

为验证优选工艺的可靠性和重现性，取大叶当归100 g，按最优工艺进行闪式提取，平行操作3份，阿魏酸的收率均值为7.01，RSD为1.20%，表明该工艺可行且稳定，具可重复性和操作性。见表4。

表4 验证实验结果

5 乙醇回流提取法

大叶当归在工业上广泛采取加热回流提取有效成分阿魏酸，根据文献报道加热回流提取大叶当归中阿魏酸的优化工艺为乙醇体积浓度70%，12倍量乙醇，提取三次，每次2.5h。按此参数制备样品3批，并按照“阿魏酸的含量测定”方法测定，计算平均结果与响应面设计闪式提取的优化结果进行对比，见表5。

图1 R1=f1(B,C) 图2 R1=f(A,B) 图3 R1=f(A,C)

表5 响应面设计闪式提取与加热回流提取的比较 (%)

6 讨论

该文采用响应面分析法对阿魏酸提取工艺进行优化 ,并得到回归方程。其最佳闪式提取工艺条件为70%的乙醇，料液比1∶12，闪式提取1min。该方法操作方便、成本低廉、效率较高、提取时间短等特点。与传统提取方法相比，闪式提取提取时间仅为乙醇加热回流提取法的1/150，且闪式提取法阿魏酸含量较高。

响应面分析法通过中心组合实验研究几种实验因素间相互作用的一种回归分析方法,和传统方法相比具有实验次数少，周期短和回归方程精确度高等优点,并能从图形方面分析寻求最优实验考察因素[12-15]。该实验利用响应面分析法设计闪式提取法所得阿魏酸提取最佳工艺 ,具有重复性好、操作方便、提取效率高等优点。

[1]黄伟晖,宋纯青.当归的化学和药理学研究进展[J].中国中药杂志,2001,26(3):147-151+155.

[2]韦玮,龚苏晓,张铁军,等.当归多糖类成分及其药理作用研究进展[J].药物评价研究,2009,32(2):130-134.

[3]裴媛,谭初兵,徐为人,等.当归苯酞类和萜类成分作用的虚拟评价[J].中草药,2010,41(6):938-941.

[4]严辉,段金廒,钱大玮,等.我国不同产地当归药材质量的分析与评价[J].中草药,2009,40(12):1 988-1 992.

[5]刘东辉,黄水清,黄月纯,等.当归补血汤皂苷类成分HPLC指纹图谱研究[J].中药材,2006,29(8):844-846.

[6]王庆敏,李晓宁,王兵,等.当归补血汤有效部位指纹图谱归属分析[J].时珍国医国药,2008,19(11):2 658-2 660.

[7]孙备,杨士友,裴月梅,等.清上蠲痛颗粒的质量标准研究[J].中国实验方剂学杂志,2001,7(6):3-5.

[8]王婕,建邦,宋平顺. 30批当归中阿魏酸、藁本内酯含量测定[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(16)，70-72.

[9]唐力英,王祝举,赫 炎,等.高效液相色谱法测定当归中阿魏酸的含量[J].中国实验方剂学杂志,2006,12(2):14-15.

[10]张慕群,孟召全,崔淑莲.调经止痛颗粒质量标准的研究[J].中国实验方剂学杂志,2010,16(4):62-63.

[11]徐鹏,钱竹,章克昌,等.响应面法优化灵芝菌丝体胞内灵芝酸的提取[J].天然产物研究与开发, 2007, 19: 104 - 108.

[12]孙振球.医学统计学[M].人民卫生出版社, 2002: 181 - 195.

[13]郭辉, 罗宇倩,章华伟,等.响应面法优化超声波辅助提取荷叶黄酮工艺研究[J].中国食品科学,2011,11(1):120-123.

[14]林维先.试验设计方法[M].大连:大连海事出版社,1995.

[15]任露泉.试验优化与设计[M].北京:高等教育出版社,2003.