液质联用法检测苯二氮卓类药物的临床应用*

★ 熊周芳 涂凤莲 汪元符

(1.南昌市新建区中医医院 南昌 330100；2.南昌市食品药品检验所 南昌 330038)

苯二氮卓类药物(Bzds)是临床应用最广泛的镇静催眠类药物，同是也是受管制的精神类药物。Bzds的药理活性来自于对中枢神经系统中GABAA受体的调节作用。Bzds在α-和γ-亚基表面与受体结合，使受体处于锁定状态，给予神经递质γ-氨基丁酸(GABA)更高的亲和力，增加氯离子通道开放的频次，从而发挥镇静催眠和抗焦虑的作用。Bzds具有亲脂性，血浆蛋白结合率高，但药代动力学差异很大，半衰期表现为短(<12h)、中(12～24h)、长(>24h)，与给药方式、给药途径、药物剂型、个体代谢差异都有关。Bzds具有较窄的治疗窗，常有药物滥用并造成急性中毒。临床使用Bzds时非常有必要开展药物监测。通过文献检索[1-8]，结果表明：以全血、尿液及其他(动物饲料、保健食品)为基质，己建立一系列相关Bzds药物检测方法，样品前处理一般采用液-液分配萃取或SPE小柱固相萃取，仪器方法有液相色谱法、LC-MS/MS法、GC-MS/MS法等。本文以全血、尿液、唾液为基质，采用QuEChERS方法处理生物样本，结合UPLC-MS/MS，建立了QuEChERS-超高效液相色谱(UPLC)-多重反应监测(MRM)-条件触发(IDA Criteria)-增强子离子扫描(EPI)的检测方法，可同时定性与定量测定Bzds(氯氮卓，咪哒唑仑，硝西泮，艾司唑仑，奥沙西泮，劳拉西泮，阿普唑仑，三唑仑，地西泮)，为临床监测提供依据。

1 仪器、试剂与材料

AB Sciex 4000 Qtrap质谱仪、ekspert ultraLC100超高效液相色谱仪(美国AB公司)；METTLER TOLEDO XS105电子分析天平(瑞士Mettler公司)；IKA VIBRAX VXR basic型旋涡混合仪(德国IKA公司)；Hettich Rotina 380R 1706型冷冻离心机(德国Hettich公司)；Reeko30位自动氮吹仪(厦门宝特有限公司)；Büchi Syncore 12位平行蒸发仪(瑞士Büchi公司)；KQ-300DB 型数控超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)；Thermo连续可调式精密移液器(20～200 μL及100～1000 μL)(美国Thermo Fisher Scientific公司)；Millipore超纯水系统(美国Millipore公司)。

试剂：乙腈(色谱纯，德国Merck公司)；甲酸铵(优级纯，阿拉丁公司)；甲酸(优级纯，阿拉丁公司)；无水硫酸镁(优级纯，阿拉丁公司)；无水醋酸钠(优级纯，阿拉丁公司)；无水硫酸钠(优级纯，阿拉丁公司)；C18(粒度约80 μm，Agela公司)；PSA(粒度约60 μm，Agela公司)；GC(粒度约70 μm，Agela公司)。

标准物质：氯氮卓(CAS：58-25-3，批号：171248)；马来酸咪达唑仑(CAS：59467-94-6，批号：171250)；硝西泮(CAS：146-22-5，批号：171217)；艾司唑仑(CAS：29975-16-4，批号：1219)；奥沙西泮(CAS：604-75-1，批号：1229)；劳拉西泮(CAS：846-49-1，批号：171253)；阿普唑仑(CAS：28981-97-7，批号：171218)；三唑仑(CAS：28911-01-5，批号：171230)；地西泮(CAS：439-14-5，批号：171225)；均来源于中国食品药品检定研究院。

样品：全血(外周血)、尿液与唾液，方法建立采用来源于健康人体的生物样本，并监测了近两年来9例住院患者样本，患者年龄18～55，病情及诊断为先兆流产、失眠、神经管能症、神经衰弱等，给药地西泮，病例号：65456、71431、72834、73522、73963、74026、74425、74723、74681，对应编号为①～⑨，于给药后1h采样。

2 方法与结果

2.1 超高效液相色谱分析条件 分析柱：Waters Atlantis T3 C18，100mm×2.1mm，3μm。柱温：40 ℃。流速：0.2mL/min。进样量：5μL。流动相：A为含0.1%甲酸的5mmol/L甲酸铵水溶液，B为乙腈。按表1进行梯度洗脱。

表1 梯度洗脱程序

2.2 质谱分析条件 电喷雾离子源(ESI)：正离子模式(ESI+)。扫描模式：多重反应监测(MRM)-条件触发(IDA Criteria)-增强子离子扫描(EPI)。扫描范围：50 Da～650 Da。气帘气压力：30 Pa。碰撞气密度：中。电离喷雾电压：5500 V。离子源温度：500 ℃。雾化气压力：60 Pa。辅助气压力：55 Pa。界面加热状态：开启。离子对选择见表2。

表2 质谱分析

注:*为定量离子，另一个为定性离子。

2.3 标准品溶液的配制 取氯氮卓、马来酸咪达唑仑、硝西泮、艾司唑仑、奥沙西泮、劳拉西泮、阿普唑仑、三唑仑、地西泮标准品各约10 mg，精密称定，以乙腈制成每1 mL中各含氯氮卓、咪达唑仑、硝西泮、艾司唑仑、奥沙西泮、劳拉西泮、阿普唑仑、三唑仑、地西泮1 mg的溶液作为混合标准品储备液，再以乙腈稀释制成每1 mL中各含10 μg的溶液作为混合标准品使用液。取混合标准品使用液以含0.1%甲酸的5 mmol/L甲酸铵水溶液按一定比例稀释，可得到各含0.5，1.0，2.0，5.0，10，25，50，100，200 ng/mL的空白溶液的标准系列工作液。精密量取此标准系列工作液200 μL与等体积空白样品混匀，按2.4 供试品溶液的制备方法制成200 μL，即得不同基质的工作用标准系列溶液。

2.4 供试品溶液的制备 取新鲜检材，以QuEChERS方式净化。

提取：精密量取全血(外周血)、尿液或唾液等不同样品各200μL置5mL离心管中，加入1mL超纯水，涡旋30s使分散均匀，加入150 mg无水硫酸镁与50 mg无水醋酸钠，涡旋30s使分散，再加入2mL含0.1%甲酸的乙腈，涡旋3 min进行提取，然后在4℃以10000r/min离心5min，分取乙腈层，重复提取一次，合并2次的乙腈提取溶液置另一5mL离心管中待净化。

净化：加入50mg无水硫酸钠，100 mg C18，50 mg PSA与50 mg GC，涡旋5 min使充分分散达到净化目的，其中C18可吸附磷酯类物质，PSA可吸附脂肪酸类物质，GC可吸附色素，然后在4℃以10000r/min离心5min，分取乙腈溶液在45 ℃平行蒸发或氮吹至干，冷却至室温后精密加入200μL含0.1%甲酸的5mmol/L甲酸铵水溶液复溶，超声30s，以5000 r/min离心，取上清液以0.22μm微孔滤膜滤至小插管内，取续滤液测定。若检样中所测药物化学成分浓度过高，可适当以流动相初始溶液稀释至线性范围内，再行测定。

2.5 专属性试验 分别以试剂空白、样品基质空白、试剂空白加入标准物质(加入浓度100ng/mL)、样品基质空白加入标准物质(加入浓度100ng/mL)，按2.4制备样品，按2.1及2.2的分析条件得到氯氮卓等9种苯二氮卓类药物成分总离子流提取色谱图及各成分定量离子对、定性离子对色谱图。结果见图1-2，试剂空白、样品基质空白均无干扰。

(I为试剂空白加入标准物质、II为全血空白加入标准物质、III为尿液空白加入标准物质、IV为唾液空白加入标准物质、V为试剂空白、VI为全血空白、VII为尿液空白、VIII为唾液空白)

图1 总离子流提取色谱图

2.6 定性确认 采用保留时间与对照品相一致，且提取的二级质谱图与标准品相一致，判为检出。氯氮卓等9种苯二氮卓类药物成分试剂空白加入标准物质与样品基质空白加入标准物质所得二级质谱图(加入浓度100 ng/mL)比较见图3。

(I为试剂空白加入标准物质、II为全血空白加入标准物质、III为尿液空白加入标准物质、IV为唾液空白加入标准物质、A～I依次为氯氮卓～地西泮、1为定量离子对、2为定性离子对)

图2 各离子对提取色谱图

2.7 线性关系及检出限、定量限考察 采用2.1项下的色谱条件，2.2项下的质谱条件，以2.3项下的不同基质工作标准系列溶液进样检测。以检测所得峰面积为纵坐标，以标准系列溶液浓度(ng/mL)为横坐标，进行线性拟合。以定性离子对和定量离子对提取的质谱图信噪比均大于3时的浓度(ng/mL)为检出限。以定性离子对提取的质谱图信噪比大于3，定量离子对提取的质谱图信噪比大于10时的浓度(ng/mL)为定量限。以在一定浓度范围内，相关系数大于0.99，为线性范围。

2.8 精密度试验 选用不同基质，加入标准品使用液，按2.4法分别制备浓度为1.0、5.0、50、100 ng/mL质控样品，每个浓度6份平行样，以相应线性拟合方程计算测得浓度并计算RSD(n=6)。以全血为基质，氯氮卓等9种苯二氮卓类药物成分RSD值在2.89%～8.65%；以尿液为基质，氯氮卓等9种苯二氮卓类药物成分RSD值在2.02%～6.54%；以唾液为基质，氯氮卓等9种苯二氮卓类药物成分RSD值在2.22%～7.26%。方法精密度符合要求。

2.9 基质效应 选用6批不同来源的不同基质，加入标准品使用液，按2.4法分别制备浓度为2.0、180 ng/mL质控样品。同时以空白溶液(含0.1%甲酸的5 mmol/L甲酸铵水溶液)制备浓度为2.0、180 ng/mL标准品溶液。以基质存在下的峰面积与不含基质的相应峰面积比值，并计算批间响应RSD(n=6)。以全血为基质，氯氮卓等9种苯二氮卓类药物成分RSD值在1.78%～7.55%；以尿液为基质，氯氮卓等9种苯二氮卓类药物成分RSD值在1.49%～8.01%；以唾液为基质，氯氮卓等9种苯二氮卓类药物成分RSD值在1.64%～7.85%。

以相应线性拟合方程计算质控样品浓度值及批间RSD(n=6)。以全血为基质，氯氮卓等9种苯二氮卓类药物成分RSD值在1.82%～8.43%；以尿液为基质，氯氮卓等9种苯二氮卓类药物成分RSD值在1.24%～6.85%；以唾液为基质，氯氮卓等9种苯二氮卓类药物成分RSD值在1.55%～7.02%。

6批不同来源的不同基质试验所得RSD值均不大于15%，符合要求。

2.10 准确度试验 按2.3方法另配一混合标准品使用液。选用不同基质，加入此标准品使用液，按2.4法分别制备浓度为1.0、2.0、100、150 ng/mL质控样品，每个浓度6份平行样，以相应线性拟合方程计算测得浓度并计算回收率。三种基质中氯氮唑、咪达唑仑、硝西泮、艾司唑仑、奥沙西泮、劳拉西泮、阿普唑仑、三唑仑、地西泮四水平加标回收率均在86.0%～98.2%之间。

(I为试剂空白加入标准物质、II为全血空白加入标准物质、III为尿液空白加入标准物质、IV为唾液空白加入标准物质、A～I依次为氯氮卓～地西泮)

图3 二级质谱图比较

2.11 稳定性试验 选用不同基质，加入标准品使用液，按2.4法分别制备浓度为2.0、180 ng/mL质控样品，室温放置，在0、1、2、4、8、12、24h分别进样，测定浓度，与标示浓度比较，偏差均在±15%范围之内。室温24h内稳定性符合要求。

2.12 质控样品使用 选用不同基质，加入标准品使用液，按2.4法分别制备浓度为2.0、100、180 ng/mL质控样品，在样品检测中同时进样测定，以质控样的检测结果(应在标示浓度±15%范围之内)对样品检测结果进行确证。

2.13 样品测定结果 选择了近2年9例住院患者样本(经本院伦理委员会批准)，处方用药均为地西泮，因地西泮半衰期在0.5～1.5h左右，选择给药后1h采样进行检测，结果见表4。

3 讨论

本法取样量小，仅200μL，以QuEChERS方式净化，简单快速，回收率高，重现性好。采用QuEChERS- UPLC-MRM-IDA-EPI模式，检出限低，方法灵敏，能同时定量与定性确证。从监测结果来看，有一定实用意义。

本法只考察了室温下的稳定性结果，样品不宜保存，应在当天检测完毕。

由于没有合适的内标物质，质控样品的确证显得尤为重要。在样品检测的同时，必须同时测定质控样品，以确保检测结果的可靠性。

表3 线性关系及检出限、定量限考察结果 ng/mL

表4 地西泮监测结果 μg/mL

从文献来看，苯二氮卓类药物的检测可应用于反兴奋剂检测[6]，也可应用于刑事检测[8]，而应用于临床监测的资料相对较少。苯二氮卓类药物药代动力学差异大，用药个体差异化明显，治疗窗口窄，易致“毒”，非常有必要开展深入的临床监测工作。本法可应用于全血、尿液、唾液等不同生物基质样本，适用范围广，可根据临床监测需要有针对性地选用，更好地贴近临床实际工作的需求。

[1]严丽娟，张峰，吴敏，等. UPLC-ESI MS/MS法定动物饲料中苯二氮卓类药物[J].分析测试学报，2011，30(11)：1 301-1 305.

[2]向甲甲，刘晓华，徐刚. 苯二氮卓类药物检测方法[J].宁波化工，2014(1)：6-9.

[3]李贤良，严爱花，郗存显，等. 液相色谱-串联质谱法同时检测牛奶中20种苯二氮卓类药物残留[J].分析实验室，2013，32(4)：42-47.

[4]严爱花，李贤良，郗存显，等. 固相萃取-液相色谱-串联质谱法同时检测猪肉中18种苯二氮卓类药物残留量[J].分析与检测，2013，39(4)：173-179.

[5]严爱花，李贤良，郗存显，等. 液相色谱-串联质谱法同时检测中成药及保健品中非法添加的22种苯二氮卓类药物[J].分析化学研究报告，2013，41(4)：509-516.

[6]张建丽，王占良，张亦农. 液相色谱-串联质谱法测定尿样中11种苯二氮卓类药物及其代谢产物[J].分析实验室，2014，33(4)：479-482.

[7]甘蓓，况慧娟，涂瑾. 磁固相萃取-液相色谱-串联质谱法检测牛肉中4种苯二氮卓类药物的残留[J].食品安全质量检测学报，2015，6(9)：3 677-3 683.

[8]王朝红，张琳，赵蒙，等. 超高效液相色谱-质谱定量测定全血中的13种苯二氮卓类安眠镇静药物[J].刑事技术，2016，41(1)：46-49.