大曲中L-谷氨酸和γ-氨基丁酸的高效液相色谱检测方法

周韩玲，廖勤俭，安明哲，李杨华，郭 艳

(四川宜宾五粮液股份有限公司技术研究中心，四川宜宾644007)

γ-氨基丁酸，简称GABA，是一种广泛分布于动植物、微生物体内的非蛋白动能性氨基酸。它参与多种代谢活动，具有很高的生理活性，是神经中枢重要的抑制性氨基酸递质。医学上，可用于肝昏迷及脑代谢障碍，还可以抗神经不安，是对抗抑郁焦虑、改善情绪、缓解压力、促进睡眠、提高脑活动、解毒醒酒的一种纯天然物质，也是一种新型的功能因子。

随着业界对γ-氨基丁酸研究的深入，微生物发酵法生产γ-氨基丁酸已经成为研究热点，如乳酸杆菌发酵生产γ-氨基丁酸的研究[1]。大曲是粮食原料网罗自然微生物自然发酵而成，其中含有丰富的微生物、酶系及发酵产物，是酿造白酒的糖化发酵剂，同时，对白酒香味成分也有很大的贡献。γ-氨基丁酸主要来源于L-谷氨酸的脱羧反应，由此，研究检测大曲中的L-谷氨酸和γ-氨基丁酸含量，对研究大曲中代谢γ-氨基丁酸的微生物以及酿酒发酵过程中L-谷氨酸和γ-氨基丁酸的生成变化，具有一定的指导意义。

此前的文献资料中，对γ-氨基丁酸的检测也有报道，如利用高效液相色谱、柱前衍生、紫外检测方式来测定发芽糙米中的γ-氨基丁酸，其中γ-氨基丁酸的提取方式为乙醇水混合溶液回流萃提[2]；测定脑脊液中谷氨酸和γ-氨基丁酸，同样采取紫外检测方式，其中目标物的提取方式也比较复杂[3]。紫外检测器选择性较低，对于基质复杂的样品，在色谱定性和定量上会出现不准确。针对大曲样品中复杂的化学成分，通过自动柱前衍生方式，利用荧光检测器进行L-谷氨酸和γ-氨基丁酸的检测，其优势在于样品无需复杂的前处理，灵敏度高，稳定性、重复性好。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器

样品：酿酒生产用大曲。

仪器设备：美国Agilent公司1100系列高效液相色谱仪(HPLC)，FLD检测器，离心机，振荡器。

耗材：L-谷氨酸和γ-氨基丁酸标准品，自购。

1.2 色谱条件

分析柱：Agilent HypersilAA-ODS 2.1×200 mm 5-micron。

流动相：A，甲醇（色谱级）；D，20 mmol乙酸钠，0.018%三乙胺调pH7.2后，加入0.3%的四氢呋喃。

梯度洗脱：0～2 min，100 D～100 D；25 min，65 D；30 min，0 D；35 min，0 D；36 min，100 D；40 min，100 D；40 min，stop。

柱温：30 ℃；流速：0.4 mL/min。进样程序：抽取5.0 μL缓冲液。

从样品瓶抽取1.0 μL；将6.0 μL混合到空气，最大速度，2次；抽取0 μL水洗针液；抽取1.0 μL的OPA衍生试剂；将6.0 μL混合到空气中，最大速度，6次；抽取0 μL水洗针液；抽取64 μL水；将36 μL混合到空气，最大速度，2次；进样。

1.3 标准品的配制

精确称取γ-氨基丁酸和L-谷氨酸，以0.1 mol/L的HCl水溶液配制成50 mL浓度为1000 mg/L的标准储备液，放置于4℃下冷藏。

1.4 样品处理

称取5份粉碎后的大曲粉末（每份1.00 g），分别置于5支15 mL离心管中，向第1支离心管中加入10 mL甲醇，第2支离心管中加入10 mL 75%甲醇水溶液，第3支离心管中加入10 mL50%甲醇水溶液，第4支离心管中加入10 mL 25%甲醇水溶液，第5支离心管中加入10 mL 0.1 mol/L的HCl水溶液，每支离心管振荡提取10 min，离心，取上清液0.1mL，用0.1 mol/L的HCl水溶液稀释至1 mL，经0.22 μm滤膜过滤后进液相色谱仪分析。

2 结果与分析

2.1 标样和样品的定性检测

取1000 mg/L的标准溶液，0.1 mol/L的HCl水溶液稀释至浓度为2.0 mg/L，进行定性检测，L-谷氨酸出峰时间为2.2 min，γ-氨基丁酸出峰时间为22.2 min。大曲样品处理方式见1.5，标样色谱图见图1，样品色谱图见图2。

图1 标准品色谱图

图2 样品色谱图

2.2 标准曲线及线性范围

取标准储备溶液，0.1 mol/L的HCl水溶液稀释至 120 μg/L、360 μg/L、1200 μg/L、3600 μg/L、12000 μg/L共5个浓度梯度，作为定量分析校正。以峰面积Y为纵坐标，以质量浓度（μg/L）为X横坐标，绘制标准曲线，结果表明，在120～12000 μg/L范围内，线性相关系数较好，能准确定量分析大曲中L-谷氨酸与γ-氨基丁酸含量。回归方程、线性相关系数及方法定量限见表1。

表1 方法回归方程、相关系数及定量限

表2 精密度试验结果(n=6)

2.3 样品中氨基酸提取方法优化结果

采用不同方法提取曲粉中的L-谷氨酸与γ-氨基丁酸，结果见图3、图4。

图3 不同方法提取曲药中L-谷氨酸结果（μg/L）

图4 不同方法提取曲药中γ-氨基丁酸结果（μg/L）

从图3、图4可看出，采用甲醇作为提取液时，曲药中氨基酸提取率较低，采用甲醇水溶液和0.1 moL/L HCl作为提取液时，效果明显好于纯甲醇，当甲醇水溶液浓度为75%时，曲药中L-谷氨酸及γ-氨基丁酸提取率最高，加之甲醇浓度越高，曲药浸泡液中糖类物质越少，对氨基酸检测干扰也越小，所以，最后选择75%甲醇水溶液作为提取液。

2.4 精密度试验

采用75%甲醇水溶液作为提取液，提取曲粉中L-谷氨酸与γ-氨基丁酸，对同一样品平行测定6次，得到γ-氨基丁酸的检测结果的相对标准偏差（RSD）为1.59%～1.72%，满足分析要求，结果见表2。

2.5 加标回收率试验

取大曲样品3份，采用75%甲醇水溶液作为提取液，其中1份作为空白本底值，另外2份大曲称入离心管后，在离心管中分别加入已知量的标准溶液，用上述实验方法进行回收率试验。试验结果表明，化合物的回收率为90.96%～101.49%，满足分析要求，结果见表3。

表3 样品中加标回收率结果

3 结论

采用75%甲醇水溶液作为提取液，曲药中L-谷氨酸与γ-氨基丁酸提取率较高，所建立检测方法的R2值、精密度、加标回收率等均较好，能准确分析大曲样品中的L-谷氨酸和γ-氨基丁酸含量。大曲样品经75%甲醇水溶液振荡提取，提取液中有机相较高，能抑制大曲中的酶促反应，离心后的上清液如需隔夜检测，需要冷藏放置。

参考文献：

[1]刘清,姚慧媛,张晖.生产γ-氨基丁酸的乳酸菌的选育及发酵条件优化[J].氨基酸和生物资源,2004(1)：40-43.

[2]房克敏,李再贵,袁汉成,等.HPLC法测定发芽糙米中的γ-氨基丁酸含量[J].食品科学,2006(4)：208-211.

[3]陈希贤,李东,吕建新,等.高效液相色谱法测定人脑脊液中γ-氨基丁酸和谷氨酸[J].色谱,1997(3)：237-239.