两种假单胞杆菌协同发酵产脂肪酶优化和酶性质研究

王 侨，秦正山，袁 涛，刘 通，王 单，邱会东

（重庆科技学院，重庆401331）

微生物脂肪酶种类多、来源广、周期短、具有比动植物脂肪酶更广的pH值和温度范围，具有较高的催化活性、稳定性和专一性，可在有机相中进行催化反应，易于工业化等优点[1]，在有机合成、洗涤剂、食品加工等诸多领域已经被广泛开发利用[2]，是一类重要的工业酶[3]。

张谦等[3]利用黑曲霉针对于G62s摇瓶发酵条件来产脂肪酶，对培养条件的优化后提高了菌株脂肪酶产量；Ma R.J.等[4]对自枯草芽孢杆菌168的编码LipA的基因在PNA和PAE启动子的控制下在BNA中表达，使菌株BNACL和BNAAL的胞外脂酶活性进一步增强，来产高活性的脂肪酶；郭晓军等[5]从富含油脂的土样中筛选芽孢杆菌菌株产脂肪酶；Zin等[6]利用酸预处理的椰子渣发酵和相容性的洗涤剂作为芽孢杆菌（Bacillus spratosphericus）底物，从而生产脂肪酶；符小燕等[7]用葡萄球菌经过微波和紫外单独诱变、微波复合紫外和紫外叠加诱变,经初筛和复筛,获得产脂肪酶活力较高的菌种来产脂肪酶,优化条件后获得的最高酶活为17.54 U/mL；蒋琰洁等[9]对酵母菌的分离和筛选,在最优条件下发酵获得脂肪酶；王旭愿等[10]采用Rashid N p-nPP比色法,通过单因素试验和正交试验对洋葱假单胞菌（Pseudomonas cepacia）产脂肪酶的培养基主要成分和发酵条件进行优化,以提高聚丁二酸丁二醇酯（PBS）的生物降解速率，结果表明：在最优培养基条件下,洋葱假单胞菌产脂肪酶活性可达32.935 U/mL；李楠等[11]采用耐冷假单胞菌Pseudomonassp.G6产脂肪酶，对其条件优化，最后产酶能达到最大值，为65.66 U/mL。相对来说，假单胞菌具有现有微生物中丰富的酶库，而且假单胞菌拥有的酶库中有一类酶-II肪酶由于其具有高立体选择性、底物专一性、位置选择性和较高的转酯活性[12-15]，广泛应用于食品加工、药物合成、手性拆分、生物能源[16-21]等各个领域，是理论和应用研究的热点。

尹利[22]采用了单因子实验筛选出产酶的最适碳源和氮源的方法，对洋葱进行假单胞菌发酵产脂肪酶，胡静[23]利用验室筛选得到的假单胞菌Pseudomonas oleovoransZJ03菌株,采用紫外诱变结合Nile Red随机定向筛选的方法高产PHA菌株,发酵生产脂肪酶。苏凤宜等[24]利用季铵盐阳离子表面活性剂重点研究十二烷基三甲基溴化铵，DTAB制备P.Putida mt-2的休止细胞，并考察表面活性剂对恶臭假单胞菌胞内酶活的影响等方法，在最优条件下生产脂肪酶。

目前，研究单一的假单胞杆菌产脂肪酶的较多，忽略了菌种协同作用产脂肪酶的能力，本研究由此选取假单胞菌种中具有代表性的荧光假单胞杆菌和绿脓杆菌作为研究对象，对菌株发酵产酶条件进行优化，提高其发酵产酶量，摸索该脂肪酶提取条件。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂

菌种：荧光假单胞菌冻干粉（GIMCC1.110)。

试剂及耗材：橄榄油；聚乙烯醇；罗丹明B；葡萄糖；α-乳糖；琼脂；绿脓杆菌冻干粉(GIMCC1.22)；LB固体培养基；牛肉膏；甘油（≥99%），其他试剂均为市售分析纯，如无水乙醇、NaOH、氯仿、(NH4)2SO4、K2HPO4、KCl、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、NaHCO3、酚酞；吐温-80等。

1.2 培养基的制备

发酵培养基：牛肉膏20 g，蛋白胨15 g，氯化钠15 g，α-乳化糖5 g，吐温-80 3%溶于1000 mL蒸馏水中，pH值自然，灭菌备用。

LB固体培养基：40 g LB固体培养基溶于1000 mL蒸馏水中，灭菌备用。

酶活检测平板：橄榄油乳化液1.2 mL，罗丹明B 0.002%，琼脂1.5，pH值自然。

橄榄油乳化液：取橄榄油与聚乙烯醇溶液按l∶3比例混合，用高速乳化机乳化3次，每次5 min，4℃保存。

1.3 菌种的活化

用接种环分别接种4份荧光假单胞杆菌和绿脓杆菌菌体于LB斜面培养基的试管内。第1份按照接种比例为荧光假单胞杆菌∶绿脓杆菌菌体（w∶w）1∶1、1∶1.1、1∶1.2、1∶1.3、1∶1.4、1∶1.5；第 2份接种比例为绿脓杆菌∶荧光假单胞杆菌菌体（w∶w）1∶1、1∶1.1、1∶1.2、1∶1.3、1∶1.4、1∶1.5；第 3 份接种单一的荧光假单胞杆菌菌体；第4份接种单一的绿脓杆菌菌体；30℃，250 r/min培养12～16 h。取0.5 mL培养液，与等体积的30%无菌甘油溶液混合，-80℃保存。

1.4 发酵实验

分别从4份甘油保存管中按照1%的接种量接种LB液体培养基，28℃培养12～16 h，作为种子瓶。发酵瓶为250 mL三角瓶，装液量30 mL。以接种量6%(v/v)的液体种子接种于发酵培养基，在30℃，150 r/min下发酵24 h，发酵液于4000 r/min下离心15 min获得上清液，测定其脂肪酶酶活。

1.5 生长曲线的测定

按接种量为6%(v/v)取液体种子于含有发酵培养基（25 mL）的三角瓶中，以30℃、150 r/min下摇瓶培养。于培养6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h、22 h、24 h时分别取样，于4000 r/min离心15 min分别获得上清液与沉淀，沉淀获得菌体，并用pH计测定发酵液pH值。将菌体置于105℃烘箱中，失水至恒重，测菌体干重。测定其600 nm处的光吸收值，绘制(t)-OD600曲线。

1.6 活力的测定

1.6.1 脂肪酶活力的测定

取2支100 mL三角瓶，分别于空白瓶(A)和样品瓶(B)中各加PVA橄榄油乳化液4 mL和0.025 mol/L pH7.5磷酸缓冲液5 mL(应把附在瓶壁上的乳化液冲下)，再于A瓶中加入95%乙醇15 mL。置于40℃水浴内预热5 min，然后在2个瓶中各加入酶液l mL立即记时，反应15 min后，在B瓶中立即加入95%乙醇15 mL中止反应，加酚酞指示剂3滴，用0.05 mol/L标准NaOH滴定至微红色为终点，消耗的NaOH溶液分别为V1、V2。对照样品的乙醇应在酶液前加入[25]。

脂肪酶活力单位(U)定义为：在试验条件下，每毫升酶液每分钟催化底物释放出1µmol的游离脂肪酸，定义为一个脂肪酶活力单位(U)，其计算公式如下：

式中：V样——滴定至终点时样品瓶中消耗的NaOH的体积，mL；

V空——滴定至终点时对照瓶中消耗的NaOH的体积，mL；

MNaOH——NaOH的摩尔浓度。

1.6.2 蛋白酶活力的测定

将含有0.9 mL pH7.2的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液和l mL 2%酪蛋白的混合液50℃水浴中预热15 min，加入0.1 mL待测样品，精确反应10 min，加入0.4 mol/L三氯乙酸2 mL终止反应，静置后以12000 r/min离心10 min，取上清液，用蒸馏水定容至10 mL，混匀后于紫外分光光度计275 nm测OD值。空白对照在加入样品之前先加2 mL 0.4 mol/L的三氯乙酸的反应体系，其余步骤相同。

酶活力单位定义(U)：在pH7.2、50℃的条件下每l min水解酪蛋白产生lµg酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位。

1.7 发酵培养条件的优化

1.7.1 初始pH值对菌株产脂肪酶的影响

初始pH值作为微生物生存的外部环境之一，对其发酵也有一定的影响。用NaOH（0.1 mol/L）或HCl（0.1 mol/L）溶液，调整培养基的起始pH值为 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。发酵液于4000 r/min下离心15 min获得上清液，测定脂肪酶活力。确定最佳pH值。其他条件不变，将最大脂肪酶活力设为100%。

1.7.2 发酵温度对菌株产脂肪酶的影响

不同的发酵温度对微生物生长及代谢产物的分泌有较大的影响。实验按1.7.1中确定的最佳pH值配制发酵培养基，以最佳接种量接种培养基，分别于16℃、18℃、20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、38℃条件下，150 r/min进行发酵产酶培养（培养时间为生长曲线测定时得到的时间）。收集发酵液，以4000 r/min离心15 min获得上清液，分别测定脂肪酶活力。以未作处理的发酵上清液作为对照，酶活力设为100%，滴定法检测酶活力。

1.7.3 金属离子对酶活的影响

发酵液经4000 r/min离心15 min，取上清液，用于测定酶活力。实验组分别向缓冲液中添加相应金属离子(Cu2+：CuSO4·5H2O；Zn2+：ZnSO4·7H2O；Al3+：AlCl3·6H2O；K+：KCl；Mg2+：MgCl2·6H2O；Ca2+：CaCl2)，终浓度5 mM。对照组不添加金属离子，并将其酶活力设为100%。

1.8 单因素正交试验的优化

对于碳源、氮源、表面活性剂和金属离子实验的结果，采用正交试验对α-乳糖、蛋白胨、吐温-80和CaCl2做4因素水平试验，结果见表1。

表1 正交试验因素水平

1.9 发酵条件优化正交试验

根据单因素试验结果，选择初始pH值、温度、摇床转速和接种量这4个发酵影响因素，正交试验发酵条件和因素水平见表2。

表2 发酵条件优化

2 结果与分析

2.1 菌株生长曲线的测定

以OD600光吸收值为指标指示菌体生长量。荧光假单胞杆菌和绿脓杆菌菌株协同生长曲线如图1所示。0～8 h为生长迟滞期，8～18 h为对数生长期，18 h之后进入稳定期，至22 h时菌体浓度基本保持稳定，略有下降。

2.2 培养基碳源对脂肪酶活力的影响

最适碳源的选择：分别以8 g/L蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、糊精、麦芽糖、橄榄油、α-乳糖作为唯一碳源进行最适碳源的筛选，实验结果见图2。

在7种碳源中，利用α-乳糖作为唯一碳源，脂肪酶的产酶量最高，为28.7 U/mL。α-乳糖作为最佳碳源，可以有效降低代谢抑制，从而提高发酵液的酶活。麦芽糖也可以促进生长，但细菌利用麦芽糖作为唯一碳源生长的速度稍低于α-乳糖碳源。在相同条件下，以糊精作为唯一碳源，菌体总量偏少，影响产酶效果。

图1 菌株生长曲线

图2 不同碳源对产酶的影响

2.3 培养基氮源对脂肪酶活力的影响

分别以10 g/L的蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、玉米浆、尿素、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵等9种有机氮源和无机氮源进行最适氮源的筛选，实验结果见图3。

以氯化铵、硫酸铵、乙酸铵作为唯一氮源进行发酵，脂肪酶的产酶量都较低，而玉米浆、牛肉膏、酵母粉等有机氮源脂肪酶的产量稍高，其中蛋白胨作为唯一氮源发酵，产酶效果最好，为28.3 U/mL。

2.4 接种比例对菌种协同发酵产酶活性的影响

菌种按照一定比例接种，接种比例过大并不利于菌体旺盛生长，因为消耗培养基中营养成分多，代谢产物也多，不利于产酶，图4为当绿脓杆菌比例为1时，变化荧光假单胞杆菌的比例；图5为荧光假单胞杆菌比例为1时变化绿脓杆菌的比例。结果表明当荧光假单胞杆菌和绿脓杆菌（w∶w）为1.3∶1或者为1∶1.1，此时的两种菌协同发酵产酶的活性最高。

图3 不同氮源对产酶的影响

图4 荧光假单胞杆菌接种比例变化与酶活性的影响

图5 绿脓杆菌接种比例的变化与酶活性的影响

2.5 发酵周期的确定

以α-乳糖作为碳源，蛋白胨作为氮源，并在不同发酵时间取样，测定脂肪酶的酶活见图6。

图6 培养时间对发酵的影响

随着培养时间的延长，脂肪酶活力呈现先上升后下降的趋势，在20 h达到峰值。在后续实验中将发酵终点控制为20 h。

2.6 绿脓杆菌和荧光假单胞杆菌协同发酵时脂肪酶的基本性质

2.6.1 最适温度

不同温度下检测酶活力结果见图7。由图7可以看出，随着温度的升高到32℃，相对酶活增大，高于32℃后相对酶活下降，在26～34℃之间，相对酶活在60%以上，在32℃时相对酶活最高，接近89.8%。

图7 温度对脂肪酶活力的影响

2.6.2 最适pH值

不同pH值条件下检测酶活的结果见图8。由图8可以看出，该脂肪酶在pH7.5之前，随着pH值升高，相对酶活增大，到7.5时相对酶活最高，达到89.6%，pH6.5～8.0之间，相对酶活保持在较高水平。当pH值大于7.5时，相对酶活开始下降，pH8.5明显降低。初始pH值过高或过低都会使微生物的生命活动减弱，对产酶有显著影响。

图8 pH值对脂肪酶活力的影响

2.6.3 酶的热稳定性

取30 mL酶液置于不同温度下保存，每隔10 min取样测定酶活性，结果见图9，温度在32℃时，酶活比较稳定，在42℃和50℃时分别处理80 min，酶活仅损失13.6%、17.9%。可以看出在32～50℃假单胞杆菌协同发酵的脂肪酶酶活比较稳定，酶活损失较小。

图9 酶的热稳定性

2.6.4 pH值稳定性

取30 mL酶液，加入等体积的不同pH值（pH5.5、6.5、7.5、8.5）的缓冲溶液，每隔10 min取样测定酶活性，结果见图10。在pH5.5～8.5荧光假单胞杆菌和绿脓杆菌协同发酵的脂肪酶活性比较稳定，其中偏碱性时更稳定，pH7.5时，处理80 min，酶活力能维持在90%以上。

2.6.5 脂肪酶催化能力

图10 酶的pH值稳定性

对比a、b、c三者的脂肪酶催化合成单甘酯，将10 g棕榈油和含一定量水的甘油2.5 g混合，加入适量脂肪酶，在各自最佳条件下进行反应，实验结果见图11。荧光假单胞杆菌和绿脓杆菌协同发酵产生的脂肪酶获得了最高的单甘酯含量，催化合成的单甘酯的效率是单一的荧光假单胞杆菌和单一绿脓杆菌的3.3倍和2.5倍，且具有较高的单位酶活性催化合成单甘酯能力，具有良好的应用前景。

图11 脂肪酶催化合成单甘酯

2.6.6 脂肪酶活性与蛋白酶活性的变化

检测发酵液的脂肪酶活性和蛋白酶活性变化如图12。蛋白酶活性在前12 h处于较低水平，18 h达到最高并持续至24 h。发酵后期脂肪酶活性有显著的下降，而同时蛋白酶活性维持在较高的水平。在发酵18 h后，荧光假单胞杆菌和绿脓杆菌协同发酵的脂肪酶产量有一个降低过程，由于荧光假单胞杆菌和绿脓杆菌协同发酵，在发酵产脂肪酶的同时，很可能其中某种单独的杆菌或者各自都分泌了蛋白酶进入发酵液，导致发酵过程中脂肪酶产量的降低。蛋白酶对脂肪酶的降解是发酵后期脂肪酶酶活下降的原因之一[29-30]，通过敲除蛋白酶基因、添加蛋白酶抑制剂等手段减少其对脂肪酶的降解，将可进一步提高脂肪酶产量。

图12 脂肪酶活性与蛋白酶活性变化

2.7 表面活性剂对菌种产酶的影响

表面活性剂可以与细胞壁上的脂蛋白结合，促使细胞壁的结构破坏，导致其通透性增大，利于脂肪酶的分泌。在发酵液培养基中以8 g/L的α-乳糖为碳源，以10 g/L的蛋白胨为氮源，分别加入6%曲拉通X-100、吐温-80、十二烷基磺酸钠（SDS）、羧甲基纤维素（CMC）于150 r/min、30℃下培养48 h后测定培养液中脂肪酶活性。

图13 表面活性剂对脂肪酶活力的影响

由图13可以看出，添加5-羧甲基纤维素低于不添加表面活性剂的培养液，说明5-羧甲基纤维素对菌种的生长或产酶有抑制作用，添加吐温-80，可促进绿脓杆菌和荧光假单胞杆菌协同产酶，十二烷基磺酸钠（SDS）的加入也对产酶有促进作用，但添加吐温-80的效果最好。

2.8 金属离子对脂肪酶活性的影响

不同的金属离子对产酶也有影响。由图14可以看出，Cu2+完全抑制脂肪酶活性，Zn2+对脂肪酶活性具有极大的抑制作用，K+和Mg2+对脂肪酶活性有一定的促进作用，Ca2+对脂肪酶的激活作用最大，酶活力为28.42 U/mL。

图14 金属离子对脂肪酶活性的影响

2.9 正交试验的优化（表3、表4）

表3 正交试验结果与分析

根据单因素试验结果，对荧光假单胞杆菌和绿脓杆菌协同作用产酶的4个因素从大到小顺序为α-乳糖、蛋白胨、吐温-80、CaCl2。即作为碳源的α-乳糖对荧光假单胞杆菌和绿脓杆菌协同作用产酶的活性影响最大，其次是蛋白胨，CaCl2的影响最小。最优组合为A1B1C1D1，荧光假单胞杆菌和绿脓杆菌协同产酶在最佳工艺条件下配制的培养基进行正交试验，平行发酵液酶活均可达到（33.361±0.05）U/mL。因此发酵培养基最优配制为：α-乳糖6 g/L、蛋白胨8 g/L、吐温-80 1%、CaCl20.5 g/L、KH2PO46 g/L、MnSO40.3 g/L、NaCl 5 g/L。

表4 发酵条件正交试验结果

通过发酵条件正交试验结果分析可知，影响荧光假单胞杆菌和绿脓杆菌协同作用产酶活性大小的因素由大到小依次是d、a、c、b，即接种量对脂肪酶活性影响最大，培养温度对酶活性影响最小，平行发酵液酶活最高可达到（33.424±0.05）U/mL，最优组合为a2b2c1d1,因此，选择脂肪酶活性最高的培养条件为接种量8%，培养温度32℃，摇床转速150 r/min，初始pH7.5。

3 结论

3.1 荧光假单胞杆菌和绿脓杆菌最佳接种比例为（w∶w）为1.3∶1，最适发酵产酶条件为α-乳糖6 g/L、蛋白胨8 g/L、吐温-80 1%、CaCl20.5g/L 、KH2PO46 g/L、MnSO40.3 g/L、NaCl 5 g/L、接种量8%、初始pH7.5、培养温度32℃、摇床转速150 r/min，在最适发酵条件下，该菌株最大产酶酶活能达到（33.424±0.05）U/mL。

3.2 在32～50℃和pH5.5～8.5假单胞杆菌协同发酵的脂肪酶酶活比较稳定，酶活损失较小。添加吐温-80对产酶有促进作用，Cu2+和Zn2+对脂肪酶活性具有极大的抑制作用，Ca2+则对脂肪酶有一定的激活作用。

3.3 荧光假单胞杆菌和绿脓杆菌协同发酵产生的脂肪酶比单一的荧光假单胞杆菌和单一的绿脓杆菌得到了高于2倍的单甘酯产量，且具有较高的单位酶活性催化合成单甘酯能力，具有良好的应用前景。

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