高效液相法检测鸡盲肠中的沙咪珠利

易远胜，郭春娜，王霄旸，张可煜，杨帆帆，孙志良，薛飞群

（1.湖南农业大学动物医学院，长沙 410000; 2.中国农业科学院上海兽医研究所 农业部兽用化学药物及制剂学重点实验室，上海 200241; 3.湖南农业大学 湖南省兽药工程技术研究中心，长沙 410000）

鸡球虫病是养鸡业中重要的常见的一种疾病，对鸡的危害十分严重，分布广泛，世界各地普遍发生，15～50日龄的雏鸡发病率高，死亡率可达80%，病愈的雏鸡，生长发育受阻，长期不能康复。成年蛋鸡多为带虫者，增重和产蛋受到一定的影响。全世界每年用于预防球虫病费用已超过数亿美元[1]。鸡球虫病作为一种寄生性原虫病，疫苗很难对其进行全面保护，宿主仍然有感染球虫的风险[2]，抗球虫药物仍然是防治畜禽球虫病的可靠手段[3]。

沙咪珠利（Ethanamizuril，EZL）是中国农业科学院上海兽医研究所在地克珠利和妥曲珠利的基础上自主研发的一种新型三嗪类抗球虫药。早期药效学研究证实其有使用剂量低、抗球虫活性高，具有成为新型抗球虫药物的潜力[4]。沙咪珠利在体内吸收较少，有利于药物在肠道保持较高的浓度，能直接作用于盲肠上的球虫[5]。本研究利用高效液相色谱法建立沙咪珠利在鸡盲肠中含量检测方法，可以更好地用于沙咪珠利的后续研究。

1 材料与方法

1.1 实验仪器 高效液相色谱仪（Waters2695，美国Waters公司）；紫外检测器（Waters2487，美国Waters公司）；氮吹仪（美国Organomation Associates公司）；双量程分析天平（AE240，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；超纯水系统（上海瑞枫生物科技有限公司）；涡旋混合器（XW-OA，上海医科大学仪器厂）；超声仪（SCQ-250，上海声谱科学仪器厂）；离心机（An-ke LXJ-ⅡB，上海安亭科学仪器厂）。

1.2 药品、试剂和动物 沙咪珠利对照品（含量≥99.8%）由中国农业科学院上海兽医研究所动物药学研究室制备；妥曲珠利亚砜（纯度99.4%±0.2%，WTTEGA Laboratorien）、己烷、磷酸均为分析醇，购自国药集团化学试剂有限公司；色谱纯乙腈购自Merck公司；其他试剂均为分析纯；文中所用水均为超纯水；实验动物购自上海闵优家禽养殖合作社。

1.3 含量测定及样品前处理

1.3.1 溶液的配制 精密称取10 mg沙咪珠利对照品置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容到10 mL，制得沙咪珠利含量为1 mg/mL的对照品储备液，取适量甲醇分别稀释成5、10、50、100、250、500、1000 μg/mL系列浓度的对照品溶液。

1.3.2 色谱条件 X TERRA MS C18（4.6×250 mm，5 μm，Waters），流动相为乙腈∶0.2%磷酸水（35∶65 v/v），流速为1 mL/min，进样量为10 μL，运行时间30 min，柱温为30℃，紫外检测波长为251 nm。

1.3.3 样品前处理 取0.5 g匀浆化鸡盲肠置于10 mL离心管中，加入20 μL内标标液（妥曲珠利亚砜TSO）后涡旋30 s，静置30 min，再加入5 mL乙腈，涡旋1 min，超声20 min后在4000×g转速下离心10 min，吸取上层有机层2.5 mL至离心管中，于60℃水浴下氮气吹干，加入1 mL流动相复溶（乙腈∶0.2%磷酸水，35∶65，v/v），再加入0.8 mL己烷，涡旋1 min后在8000×g转速下离心10 min，吸取下层过0.22 μm滤膜，进样测定。

1.4 方法学考察

1.4.1 专属性考察 取空白盲肠和空白加样盲肠分别按照前处理方法进行处理，在确定的色谱条件下进行进样，观察在EZL和TSO保留时间处有无杂峰干扰，从而判断专属性是否良好。

1.4.2 检测限和定量限 将EZL标准溶液逐级稀释到合适浓度后加入空白盲肠中，按照前处理方法进行处理，按照色谱方法进行进样测定，以色谱图中沙咪珠利峰信噪比（s/n）≥3时的浓度作为检测限；以信噪比（s/n）≥10时的浓度作为定量限。

1.4.3 标准曲线的制备 在0.5 g空白鸡盲肠中加入沙咪珠利标准溶液20 μL，配置成样品浓度为0.2、0.4、2、4、10、20、40 mg/kg的标准样品，每个浓度5个平行样品，按照前处理方法处理鸡盲肠样品，进样测定，记录色谱图中沙咪珠利和妥曲珠利亚砜的峰面积，以样品中EZL浓度为横坐标，以沙咪珠利与妥曲珠利亚砜峰面积的比值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.4.4 准确度和精密度 准确度用相对回收率表示。取0.5g空白鸡盲肠，添加沙咪珠利标准溶液各20 μL，使样品浓度分别为0.4、4、20 mg/kg，按照前处理方法进行处理，进样测定，每个浓度5个平行

样品，样品的相对回收率根据当天制备的标准曲线计算。精密度包括日内精密度和日间精密度。精密度用日内和日间的标准偏差（RD）或相对标准偏差（RSD）表示。制备0.4、4、20 mg/kg 3个浓度的标准样品，每个浓度5个平行样品，按照前处理方法处理鸡盲肠，进样测定，根据当天制备的标准曲线计算每个浓度实测值之间的相对标准偏差，计算日内精密度。按照上述方法连续处理检测3 d，计算日间精密度。

1.4.5 样品稳定性 本实验考察了2个浓度的鸡盲肠样品在室温和3次冻融后的稳定性。制备两组含量浓度分别为2、5 mg/kg的鸡盲肠样品，第一组经室温放置8 h后按照1.4.2中的方法处理并进样测定，记录沙咪珠利和妥曲珠利亚砜的峰面积；第二组处理方法是将盲肠样品放置于-40℃冰箱保存24 h后取出自然解冻，完全解冻后再次将盲肠样品放置于-40℃冰箱，如此反复3次后，将其按照1.4.2中的方法处理并进样测定，记录沙咪珠利和妥曲珠利亚砜的峰面积，通过标准曲线方程计算出相对回收率。

2 结果

2.1 方法的专属性 由图1可知，在鸡盲肠样品中，EZL保留时间为7.4 min，TSO的保留时间为26.1 min，无杂质干扰，专属性良好。

图1 鸡盲肠中沙咪珠利含量检测的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of the determination of Ethanamizuril in chicken caecum

2.2 检测限和定量限 按照1.4.2中的方法操作，以沙咪珠利峰和噪音的比值s/n≥3时的浓度为检测限，由此得到本检测方法的检测限为0.04 mg/kg；同理，以s/n≥10的浓度为定量限，得到本检测方法的定量限为0.2 mg/kg。

2.3 标准曲线 按照1.4.3的方法制备并处理标准鸡盲肠样品，制作标准曲线。以EZL/TSO峰面积比值为y，以样品中EZL浓度（mg/kg）作为x，计算得到的标准曲线方程为y=0.515x+0.00461，r2=0.994，测定范围为0.2～40 mg/kg，具有良好线性关系，见图2。

图2 检测鸡盲肠内EZL的标准曲线Fig.2 Linear correlation of standard curve of Ethanamizuril in chicken caecum

2.4 准确度和精密度 按照1.4.4中的方法操作，本研究考察了0.4、4、20 mg/kg 3个浓度的准确度和精密度，准确度用相对回收率表示，精密度用RSD表示，见表1。

表1 鸡盲肠中沙咪珠利含量检测准确度和精密度Table 1 Recovery and precision results of Ethanamizuril in chicken caecum

2.5 稳定性考察 按照1.4.4中方法操作，本研究考察了2个添加浓度分别在室温和经过3次冻融后的样品稳定性，获得数据如表2、表3所示。

表2 鸡盲肠加标样品室温放置8 h稳定性试验结果Table 2 Stability of chicken caecum spiked samples in 8 h at room temperature

表3 鸡盲肠中加标样品冻融3次稳定性试验结果Table 3 Stability of chicken caecum spiked samples after freeze-thaw cycles

3 讨论

沙咪珠利属于三嗪类化合物，与地克珠利结构式类似，都几乎不溶于水[6]。随着现代分析和检测技术的发展，快速、简便、高灵敏度和准确度的检测并可量化生物组织内的药物的方法得以出现，为药物在实验动物体内的药代动力学研究打下了基础[7]。沙咪珠利在肾脏组织中会代谢成M3，在盲肠处理过程中并未发现沙咪珠利代谢成M3[8]。对样品的提取方法研究中，本实验比较了甲醇和乙腈分别单独提取沙咪珠利和内标妥曲珠利亚砜的提取效率，经检测发现乙腈提取效率较高，沉淀蛋白能力较强，且提取后内源性物质对于目标物质检测无干扰。试验中发现用乙腈提取后溶液呈现淡黄色，还有脂肪成分，因此加入己烷进行除脂，减少了杂质干扰。流动相选择采用乙腈和0.2%磷酸水，在水相中加入0.2%磷酸后能显著改善沙咪珠利的峰型；提高有机相比例有杂质干扰内标妥曲珠利亚砜的检测，为消除干扰，适当降低有机相比例，当乙腈∶0.2%磷酸水为35∶65（v/v）时，沙咪珠利和妥曲珠利亚砜都没有杂质干扰。

本研究建立了检测鸡盲肠中沙咪珠利含量的高效液相色谱方法，经过方法学验证，线性良好，r2=0.994，回收率为90%～107%，批内批间精密度为2.37%～6.80%，均符合样品检测的要求。该方法操作简便快捷、重现性好，能满足鸡盲肠中沙咪珠利含量的检测要求。

[1] 李国清. 兽医寄生虫学： 双语版[M]. 北京： 中国农业大学出版社, 2006.

[2] 才凤峰. 鸡球虫病的防治——抗球虫药的使用[J]. 中国家禽, 2004, 26(6)： 30-34.

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[5] 张可煜, 李素梅, 王霄旸, 等. 大鼠粪便中抗球虫新药沙咪珠利的HPLC检测方法研究[J]. 中国动物传染病学报,2014(4)：45-49.

[6] 肖文龙, 张可煜, 吴昊, 等. 高效液相色谱法(HPLC)测定饲料中AC4的含量[J]. 饲料工业, 2014, 35(3)： 54-57.

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