microRNA-15a在阿尔茨海默病中的作用及机制

汪元浚　杨发满　董庆玲　张培莉　刘　冀　李　蓉　李晓平　敬泽慧

(青海大学附属医院老年科，青海　西宁　810001)

阿尔茨海默病(AD)又称老年痴呆，病因及病理生理改变受环境及遗传等多种因素影响，其发生发展的分子生物学机制尚未阐明〔1，2〕。miRNA是一类广泛存在于哺乳动物中高度保守的非编码小RNA分子，能够与靶基因mRNA的3′非翻译区特异性结合，进而抑制或降解靶基因mRNA，实现其在转录后水平的调控。有研究表明超过70%的mRNA能够表达于脑内，对神经元细胞及胶质细胞发挥调控作用〔3〕。AD血清中存在着多种miRNA的异常表达，但具体的作用机制尚不明确〔4～6〕。本研究旨在探讨miR-15a在AD中的作用及相关机制。

1　材料和方法

1.1材料来源2016年 6 月至 2017年 4月经青海大学附属医院老年内科诊断及治疗的AD患者血液标本30例为AD组，男20例，女10例，平均年龄(77.9±12.4)岁；正常健康血液样本30例为对照组，男14例，女16例，平均年龄(73.4±11.8)岁。大鼠神经细胞株(PC12)细胞购于中国科学院上海细胞库。两组性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2主要试剂及仪器TRIZOL总RNA提取试剂、TIANScript cDNA第一链合成试剂盒均购自北京天根生物化学试剂公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒，Annexin V-FITC/PI流式双染试剂盒购自碧云天生物技术研究所；兔抗B淋巴细胞瘤(Bcl)-2，c-myc，还原型辅酶Ⅱ(GAPDH)多克隆抗体均购自美国Abcam公司；天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)3及Caspase9活性检测试剂盒购自南京凯基生物科技有限公司；miR-15a NC及miR-15a mimics由广州锐博生物技术有限公司合成。168-1000XC型酶标仪，FACSCalibur型流式细胞仪购于美国BD公司；Labworks凝胶扫描成像系统购自美国UVP公司；PTC-250梯度PCR仪购自美国MJ Research 公司；DYY-Ⅲ稳压电泳仪购自北京六一仪器厂；5417R低温高速离心机，Biophotometer核酸蛋白检测仪购自德国Eppendorf。

1.3Realtime PCR检测miR-15a表达水平TRIZOL试剂一步法提取血液白细胞层总RNA，紫外分光光度法测定总RNA的纯度，根据吸光值计算样品总RNA纯度，当RNA样品纯度在1.8～1.9，说明提取的总RNA纯度好，能够满足下一步实验的要求。取焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的0.2 ml PCR反应管，加入样品总RNA 5 μg、随机引物1 μg，再加DEPC dd H2O补足至20 μl，70℃变性5 min，进行cDNA第一链合成。基于SYBR Green I荧光分析的Realtime PCR分析，预变性95℃，15 min；变性95℃，20 s；退火60℃，34 s；40个循环。用2-△△CT法鉴定miR-15a的表达量，其中△△CT=(待测组目的基因CT值-待测组内参基因CT值)-(对照组目的基因CT值-对照组内参基因CT值) 。

1.4实验分组采用20 μmol/L的淀粉样蛋白(Aβ25～35)诱导PC12细胞制作AD细胞模型，并将诱导成功的PC12细胞随机分为模型组、阴性对照组、促进组，其中阴性对照组及促进组分别利用脂质体LipofectamineTM3000转染miR-15a NC及miR-15a mimics；另外选取不加任何药物刺激的PC12细胞作为正常对照组。

1.5噻唑蓝(MTT)法检测细胞活力将5×103个PC12细胞接种于96孔板培养24 h，按“1.4”分组及给药后，加入20 μl的MTT孵育4 h后，将上清液弃去，加入150 μl的二甲基亚砜使结晶物溶解，酶标仪测定OD570 nm值。

1.6Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡将8×103个PC12细胞接种到6孔板培养24 h，按“1.4”分组及给药后，每组收集1×105/ml个细胞，加入结合缓冲液吹打混匀后，依次加入5 μl的Annexin V-FITC及PI吹打混匀，并于室温下避光孵育10 min，最后进行流式检测，对细胞凋亡情况进行分析。

1.7细胞中Caspase3及Caspase9活性的检测将8×103个PC12细胞接种于6孔板培养24 h，按“1.4”分组及给药后，利用胰蛋白酶消化细胞并收集，后按照Caspase3及Caspase9活性试剂盒说明书检测活性，酶标仪测定OD405 nm值，OD值即代表Caspase活性。

1.8Western印迹检测Bcl-2及c-myc蛋白表达将8×103个PC12细胞接种于6孔板培养24 h，按“1.4”分组及给药后，冰浴条件下收集细胞并裂解，获得的上清液即是总蛋白。BCA试剂盒测定蛋白浓度，蛋白样品煮沸变性。制作浓缩胶及分离胶，并上样，进行凝胶电泳，聚偏氟乙烯(PVDF)转膜，脱脂奶粉封闭，一抗4℃过夜，次日二抗孵育，最后在凝胶成像系统中曝光。

1.9统计学方法应用SPSS17.0软件进行t检验。

2　结　果

2.1miR-15a在AD和对照组血液中的表达AD组miR-15a表达量(11.201±6.55)低于对照组(20.58±5.62)，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.2miR-15a mimics对Aβ25～35诱导的PC12细胞中miR-15a表达量的影响与正常对照组(4.89±0.48)比较，模型组及阴性对照组miR-15a表达量(1.95±0.20，1.94±0.19)显著降低(P<0.01)；与模型组及阴性对照组比较，促进组(4.78±0.48)显著提高(P<0.01)。

2.3miR-15a mimics对Aβ25～35诱导的PC12细胞活力及细胞凋亡的影响如表1所示，与正常对照组比较，模型组及阴性对照组细胞活力显著降低，细胞早期凋亡率及晚期凋亡率均显著提高(均P<0.01)；与模型组及阴性对照组比较，促进组细胞活力显著提高，细胞早期凋亡率及晚期凋亡率均显著降低(均P<0.01)。

表1　miR-15a mimics对Aβ25～35诱导的PC12细胞活力及细胞凋亡的影响

与正常对照组比较：1)P<0.01；与模型组及阴性对照组比较：2)P<0.01；下表同

2.4miR-15a mimics对Aβ25～35诱导的PC12细胞中Caspase3及Caspase9活性的影响与正常对照组比较，模型组及阴性对照组细胞中Caspase3及Caspase9活性显著提高，与模型组及阴性对照组比较，促进组均显著降低(均P<0.01)。见表2。

2.5miR-15a mimics对Aβ25～35诱导的PC12细胞中Bcl-2及c-myc蛋白表达的影响与正常对照组比较，模型组及阴性对照组细胞中Bcl-2及c-myc蛋白表达量显著下调，与模型组及阴性对照组比较，促进组均显著上调(均P<0.01)。见表2，图1。

表2　miR-15a mimics对Aβ25～35诱导的PC12细胞中Caspase3、Caspase9活性及Bcl-2、c-myc蛋白表达的影响

图1　miR-15a mimics对Aβ25～35诱导的PC12细胞中Bcl-2及c-myc蛋白表达的影响

3　讨　论

Hill等〔3〕发现了AD患者脑组织中存在着miRNA的异常表达，也在AD患者外周血及脑脊液中发现了miRNA(包括miR-29，miR-15，miR-107，miR-181及miR-146等)的差异性表达，这些miRNA可能直接或间接通过调控靶基因的表达或降解参与AD的发生发展〔3〕。miR-15家族包括miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-195、miR-424、miR-497、miR-503及miR-646等。其中miR-15a位于人染色体13q14区域，是第一个被报道与肿瘤发生密切相关的miRNA，在众多肿瘤组织中表达下调甚至缺失〔7〕，Liu等〔4〕研究发现AD新西兰大白兔模型脑组织中miR-15a表达量下调。Satoh等〔5〕通过miRNA序列数据分析48例AD患者及22例正常对照血液中miRNA的表达，结果发现miR-15a在AD血液中表达量下调。Bekris等〔6〕研究发现AD患者脑组织、脑脊液及血液中miR-15a表达量下调。但miR-15a在AD发生发展过程中的作用尚未见报道。本研究结果与以往研究一致〔4～8〕，miR-15a在AD血液中低表达，提示miR-15a在AD发生发展过程中起着重要作用。

AD患者海马及皮层中Aβ的沉积能够选择性地损伤海马神经元或皮层的胆碱神经元，是AD等神经退行性疾病发生过程中神经元最终的结局，也是AD的主要病理特征。本研究参考相关文献〔8，9〕，结果表明miR-15a mimics能显著提高Aβ诱导的PC12细胞活力，且对Aβ诱导的PC12细胞凋亡具有显著的抵抗作用。细胞凋亡受多种基因调控，细胞凋亡基因是其中一种，Bcl-2是最为常见的抑制细胞凋亡蛋白，能够与促凋亡蛋白Bax形成异二聚体，阻断凋亡信号传递到Caspase家族，促进细胞存活与增殖。Caspase家族蛋白正常情况下以无活性酶原形式存在，在受到上游凋亡信号诱导后，Caspase9被活化，并通过级联放大反应，将凋亡信号传递到Caspase3，最终诱导细胞凋亡。另外c-myc是原癌基因myb转录因子的一种，能够调控多种基因表达，进而参与细胞的增殖、细胞周期等。研究显示Bcl-2及c-myc是miR-15a下游靶基因〔7〕，本研究结果表明miR-15a mimics能显著降低Caspase3、9活性，并上调Bcl-2、c-myc表达，进而抑制Aβ诱导的PC12细胞凋亡。

1Bature F，Guinn BA，Pang D，etal.Signs and symptoms preceding the diagnosis of Alzheimer′s disease：a systematic scoping review of literature from 1937 to 2016〔J〕.BMJ Open，2017；7(8)：e15746.

2郭敏，李树民，张弘，等.阿尔兹海默病的表观遗传学机制研究进展〔J〕.中国临床药理学杂志，2014；30(3)：232-4.

3Hill JM，Lukiw WJ.MicroRNA (miRNA)-mediated pathogenetic signaling in Alzheimer′s disease (AD)〔J〕.Neurochem Res，2016；41(1-2)：96-100.

4Liu QY，Chang MN，Lei JX，etal.Identification of microRNAs involved in Alzheimer′s progression using a rabbit model of the disease〔J〕.Am J Neurodegener Dis，2014；3(1)：33-44.

5Satoh J，Kino Y，Niida S.MicroRNA-seq data analysis pipeline to identify blood biomarkers for Alzheimer′s disease from public data〔J〕.Biomark Insights，2015；10：21-31.

6Bekris LM，Lutz F，Montine TJ，etal.MicroRNA in Alzheimer′s disease：an exploratory study in brain，cerebrospinal fluid and plasma〔J〕.Biomarkers，2013；18(5)：455-66.

7韩旭，陈松，张济，等.miR15a靶蛋白依赖性的功能研究进展〔J〕.生命科学研究，2013；17(5)：441-6.

8袁芳，徐琦，盛磊，等.琐琐葡萄多糖对β淀粉样蛋白诱导PC12细胞凋亡的影响〔J〕.中国老年学杂志，2015；35(19)：5372-3.

9刘玲，王淑英，王建刚.PI3K/Akt通路在芍药苷抗Aβ_(25-35)诱导PC12细胞凋亡中的作用〔J〕.中国中药杂志，2014；39(20)：4045-9.