miR-183对小鼠学习记忆的影响及作用机制

林培珺　王　鹏　陈　静　向东方　毛高峰　

(武汉市精神卫生中心抑郁病房，湖北　武汉　430000)

1解放军161医院神经内科

微小RNA(miRNAs)在进化上高度保守，且不编码蛋白，可通过与其特异性的靶mRNA结合，降解或抑制蛋白的翻译，从而对基因的表达进行调控〔1〕。中枢神经系统也有多种miRNA表达，且一些miRNA特异性在脑组织的各个亚区表达〔2〕。大量研究显示，特异性的miRNA影响神经系统树突生长、神经发生、树突棘形态等生理过程〔3～5〕。miR-183基因簇存在于多数的后口动物中，是一个高度保守的基因簇，有研究显示，在人和小鼠的大脑皮质中有miR-183的特异性表达，参与大脑皮层发育及神经细胞分化的调控，但miR-183对学习记忆的影响研究尚不清楚〔6〕。本研究在小鼠大脑海马齿状回注射miR-183的抑制试剂锁核酸(LNA)-miR-183，Morris水迷宫检测小鼠的行为学变化，并检测记忆相关蛋白突触后致密蛋白(PSD95)、NR2B、NR1的蛋白表达。

1　材料与方法

1.1主要试剂和仪器Trizol购自美国Invitrogen；荧光定量试剂盒及反转录试剂盒购自日本Takala；LNA抑制探针购自美国EXIQON；二喹啉甲酸(BCA)试剂盒购自碧云天生物技术研究所；Morris 水迷宫及记录仪购自中国泰盟；脑立体定位仪购自中国瑞沃德。

1.2实验动物C57/BL Wild-Type 2月龄雄性小鼠由武汉大学动物实验中心提供，小鼠继续饲养至3～4月龄用于实验研究。饲养期间每笼限制个数，按照12 h的黑暗交替规律作息。采取自由饮水和采食。动物处理按照1995年神经科学协会的《动物使用政策》的规章制度执行。

1.3miR-183在小鼠海马中的表达冰上分离双侧海马，大约25 mg，Trizol法提取海马中的总RNA，紫外分光光度计根据OD260 nm/280 nm值确定RNA的纯度和浓度，取2 μg的总RNA，根据逆转录试剂盒的操作说明反转录总RNA为cDNA，以cDNA为模板，以U6作为内参基因，利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测miR-183的mRNA表达。利用2-△△Ct法对各样品的Ct值进行基因的表达分析。

1.4抑制miR-183后小鼠的行为变化水迷宫实验检测小鼠的学习记忆能力。首先采用立体定位技术在小鼠大脑海马齿状回注射miR-183的抑制试剂LNA-miR-183，同时设置生理盐水为阴性对照及无关对照LNA-Scramble，72 h后检测相应的行为学变化。

1.5Western印迹脱臼处死小鼠，分离出全脑，预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤脑表面的血迹，置于冰上小平皿上快速分离出双侧的海马，放入已干净的离心管中，匀浆离心后取上清，BCA法测定蛋白的浓度。蛋白样品与上样缓冲液按照1∶10比例充分混匀，置于100℃煮沸变性10 min，取等量蛋白样品依次进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离、聚偏氟乙稀(PVDF)转膜、5%脱脂奶粉封闭，分别加入PSD95、NR2B、NR1(均按照1∶500稀释)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH，1∶1 000稀释)一抗，4℃过夜，Tris盐酸缓冲液(TBST)洗涤(3次×10 min)，加入1∶5 000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG，室温孵育1 h，化学增强发光法(ECL)显色，显影后采用Gel-Pro analyzer分析各个条带的光密度，以GAPDH作为内参蛋白，分析PSD95、NR2B、NR1的蛋白相对表达量。

1.6统计学方法应用SPSS21.0软件进行单因素方差分析及t检验。

2　结　果

2.1海马和皮质中miR-183的表达小鼠海马和皮质中miR-183 mRNA表达(0.71±0.08，0.62±0.06)均显著低于对照组(1.00±0.05，P<0.01)。

2.2抑制内源性miR-183对小鼠学习记忆能力的影响对照组、LNA-Scramble组和LNA-miR-183组在1 d的潜伏期分别为(79.2±0.07)、(78.2±0.11)、(77.1±0.26)s，2 d的潜伏期分别为(58.8±2.69)、(56.8±2.83)、(61.2±3.23)s，3 d的潜伏期分别为(46.2±3.21)、(46.0±3.45)、(48.9±3.11)s，4 d的潜伏期分别为(42.1±4.12)、(41.5±4.09)、(44.6±4.03)s，5 d的潜伏期分别为(38.8±4.06)、(37.2±3.98)、(46.8±3.46)s，6 d的潜伏期分别为(24.3±3.21)、(26.8±3.18)、(42.9±3.65)s，平台通过次数分别为(4.1±0.43)、(4.3±0.41)、(1.9±0.32)次，与对照组比较，LNA-miR-183组小鼠训练阶段的潜伏期延长，记忆检测阶段时穿越平台位置的次数也明显减少，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.3抑制内源性miR-183对PSD95、NR2B、NR1蛋白表达的影响对照组、LNA-Scramble组和LNA-miR-183组PSD95的蛋白表达分别为(0.514±0.042)、(0.507±0.041)、(0.161±0.024)，NR2B的蛋白表达分别为(0.142±0.019)、(0.148±0.020)、(0.091±0.012)，NR1的蛋白表达分别为(0.358±0.032)、(0.361±0.033)、(0.082±0.011)，LNA-miR-183组均显著低于对照组(P<0.01)。见图1。

图1　抑制内源性miR-183对PSD95、NR2B、NR1蛋白表达的影响

3　讨　论

目前已发现多种表达异常的miRNA可能与学习记忆的发生有关〔7〕。有研究显示，miR-183可参与帕金森病的发生〔8〕。关于miR-183基因对学习记忆的影响尚不清楚。

Morris水迷宫是检测海马依赖最经典的方法。PSD95是在谷氨酰胺能突触后的致密区中发现的特殊蛋白质，可参与突触链接的维持和形成，在整合和介导N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体信号转导中发挥关键作用。有研究显示，PSD95基因的敲除可引起小鼠学习记忆功能及长时程增强的改变〔9〕。NMDA受体由NR(1～3)3种亚甲基组成，NR2又分为NR2A、NR2B、NR2C、NR2D，NR2B是NMDA受体发挥作用不可缺少的亚基之一，被称为“聪明的基因”，可以多种方式影响学习记忆和突触的可塑性〔10〕。本研究结果提示，抑制内源性miR-183表达可损伤学习记忆能力，可能与PSD95、NR2B、NR1的蛋白表达下调有关。

1Eichhorn SW,Guo H,McGeary SE,etal.mRNA destabilization is the dominant effect of mammalian microRNAs by the time substantial repression ensues〔J〕.Mol Cell,2014;56(1):104-15.

2Cheung IY,Farazi TA,Ostrovnaya I,etal.Deep MicroRNA sequencing reveals downregulation of miR-29a in neuroblastoma central nervous system metastasis〔J〕.Genes,2014;53(10):803-14.

3Cheng TL,Wang Z,Liao Q,etal.MeCP2 suppresses nuclear microRNA processing and dendritic growth by regulating the DGCR8/Drosha complex〔J〕.Dev Cell,2014;28(5):547-60.

4吕路,梅蕊,彭樊,等.Akt信号通路在非典型性抗精神病药物阿立哌唑调节海马神经细胞凋亡中的作用〔J〕.中国老年学杂志,2017;37(9):2110-2.

5Bicker S,Khudayberdiev S,Weib K,etal.The DEAH-box helicase DHX36 mediates dendritic localization of the neuronal precursor-microRNA-134〔J〕.Genes Dev,2013;27(9):991-6.

6McSweeney KM,Gussow AB,Bradrick SS,etal.Inhibition of microRNA 128 promotes excitability of cultured cortical neuronal networks〔J〕.Genome Res,2016;26(10):1411-6.

7Williamson VS,Mamdani M,McMichael GO,etal.Expression quantitative trait loci (eQTLs) in microRNA genes are enriched for schizophrenia and bipolar disorder association signals〔J〕.Psychol Med,2015;45(12):2557-69.

8Alsharafi W,Xiao B.Dynamic expression of microRNAs (183,135a,125b,128,30c and 27a) in the rat pilocarpine model and temporal lobe epilepsy patients〔J〕.CNS Neurol Disord Drug Targ,2015;14(8):1096-102.

9Takei Y,Kikkawa YS,Atapour N,etal.Defects in synaptic plasticity,reduced NMDA-receptor transport,and instability of postsynaptic density proteins in mice lacking microtubule-associated protein 1A〔J〕.J Neurosci,2015;35(47):15539-54.

10MacDougall G,Anderton RS,Edwards AB,etal.The neuroprotective peptide poly-arginine-12 (R12) reduces cell surface levels of NMDA NR2B receptor subunit in cortical neurons;investigation into the involvement of endocytic mechanisms〔J〕.J Mol Neurosci,2017;61(2):235-46.