IL-1β在桥本甲状腺炎外周血中的表达及其与TgAb和TPOAb的关系

戴　庆　何　军　张　凡　戴荣峰　韩　艳　蒋　琳

(常州市第三人民医院急诊科，江苏　常州　213001)

1常州市第三人民医院内分泌科

2南京医科大学第一附属医院内分泌科

桥本甲状腺炎(HT)是一种临床常见的引起甲状腺功能减退的自身免疫性疾病，具有早期症状不明显、发展缓慢和病程长等特点。HT的发病人群多集中在30～50岁，且女性的发病率明显高于男性〔1〕。研究认为HT发病与机体免疫系统紊乱、甲状腺内出现淋巴细胞和细胞因子浸润等密切相关，但具体发病机制尚不清晰〔2〕。研究发现，甲状腺分泌的细胞因子如白细胞介素(IL)-14、IL-17和IL-23等在HT患者外周血中的表达增高，可能参与HT的机体免疫紊乱过程〔3～5〕。但有关IL-1β在HT患者外周血中的表达研究较少。本研究拟分析IL-1β在HT外周血中的表达及其与抗甲状腺球蛋白抗体(TgAb)和抗甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)的相关性。

1　材料与方法

1.1对象和试剂收集2015年7月至2016年3月在常州市第三人民医院确诊为HT的患者20例为HT组，其中男4例，女16例，平均年龄(46.12±18.65)岁。经临床诊断及实验室检测证实，行甲状腺细针穿刺活检确诊。收集同期健康体检者20人为对照组，其中，男5人，女15人，平均年龄(42.86±12.28)岁。所有研究对象排除妊娠或哺乳期、肿瘤病史、肾功能不全、感染性疾病和糖尿病等其他自身免疫性疾病，且近期未使用免疫抑制剂等影响甲状腺功能的药物。

Trizol试剂购于中国大连宝生物技术有限公司，AB2720型PCR仪购于美国Thermo公司，罗氏Cobase 601型全自动电化学发光免疫分析仪购于日本瑞士罗氏公司，二喹啉甲酸(BCA)总蛋白检测试剂盒、逆转录试剂盒和SYBR Premix Ex Taq TMⅡ试剂盒均购于北京碧云天生物有限公司。β-肌动蛋白(β-actin)鼠源单抗、IL-1β单克隆抗体和辣根过氧化物酶(HRP)-山羊抗兔IgG二抗均购于美国Santa cruz公司。

1.2标本收集研究对象均于晨起收集10 ml空腹肘静脉血，分别于灭菌的含肝素抗凝管和非抗凝真空管中存放5 ml。抗凝管血样处理方法：采用聚蔗糖泛影葡胺密度梯度离心法(Ficoll)分离和纯化外周血单个核细胞；非抗凝真空管血样处理方法：室温条件下自行凝固1 h后，4 ℃ 15 000 r/min离心10 min，EP管收集上清液，于-80℃下保存备用。

1.3实时荧光定量(Real Time)PCR检测IL-1β mRNA表达收集对照组和HT组外周血单个核细胞，采用Trizol法提取总RNA，按照逆转录试剂盒说明书将总RNA逆转录为cDNA，根据SYBR Premix Ex Taq TMⅡ试剂盒说明书进行Real Time PCR。以β-actin为内参，采用2-△△Ct法计算IL-1β mRNA表达水平。实验重复3次，取平均值。

1.4Western印迹检测IL-1β蛋白表达取对照组和HT组外周血单个核细胞，以单去污裂解液提取细胞总蛋白，BCA法检测其浓度。以每孔50 μg蛋白样品在12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中进行蛋白电泳，转膜。37℃下以5%脱脂奶粉封闭1 h后，加入鼠抗人β-actin和IL-1β单克隆抗体(1∶500倍稀释)，4℃孵育过夜，再加入HRP-山羊抗兔IgG(1∶1 000倍稀释)，37℃下孵育2 h。以化学发光法显色，Bio-Rad系统扫描分析目的蛋白的表达量。以IL-1β灰度值/β-actin灰度值表示IL-1β表达水平。

1.5电化学发光法测定血清中TgAb和TPOAb水平取解冻后的血清，采用电化学发光法测定血清中TgAb和 TPOAb水平，采用罗氏Cobas e601型全自动电化学发光免疫分析仪进行检测。所有操作步骤严格按照产品说明书进行。

1.6统计学方法应用SPSS20.0软件进行t检验、Pearson相关性分析。

2　结　果

2.1两组外周血中IL-1β mRNA及蛋白表达对照组IL-1β mRNA及蛋白表达水平(0.06±0.02，0.21±0.06)明显低于HT组(1.12±0.26，1.55±0.42；均P<0.05)。见图1。

图1　Western印迹检测结果

2.2IL-1β水平与TgAb和TPOAb的相关性HT患者血清中TgAb和TPOAb表达水平分别为(368.72±132.48)U/ml和(995.82±289.93 )U/ml。IL-1β表达水平与TgAb、TPOAb均呈正相关(r=0.679、0.745，P=0.001、0.000)。

3　讨　论

IL-1是一种关键的致炎细胞因子。IL-1β是IL-1家族中的一种异构形式，是由活化的单核或巨噬细胞产生的关键免疫调节和促炎细胞因子。IL-1β由炎性体半胱天冬酶(Caspase)-1激活分子活性，参与病原体等多种相关分子产生的应答反应。研究发现，IL-1β与糖尿病、类风湿关节炎和阿尔茨海默病等多种疾病的发生发展过程密切相关〔4〕。Yan等〔6〕研究发现，通过靶向IL-1β和IL-1受体拮抗剂间失衡，能达到改善糖尿病小鼠角膜上皮愈合延迟的作用。Li等〔7〕在评估miR-155与类风湿关节炎患者外周血中的肿瘤坏死因子(TNF)-α和IL-1β异常表达的关系中发现，抑制miR-155的靶点SOCS1可上调TNF-α和IL-1β表达。雷洪涛等〔8〕指出阿尔茨海默病血液和脑脊液中 IL-1β、TNF-α水平升高，在介导脑组织炎症病理反应中具有重要作用。

TgAb是一种甲状腺滤泡柱状细胞内的糖蛋白，TPOAb是一类分布在甲状腺细胞顶缘和内质网内膜的结合糖蛋白，血清中高滴度的TgAb和TPOAb是HT患者的主要特征〔9〕。TgAb和TPOAb作为机体免疫功能紊乱的标志，通过与抗体依赖的细胞介导的细胞毒性反应，使甲状腺组织受损，与HT的发病密切相关〔10〕。本研究结果发现，IL-1β的高表达与HT的自身免疫活动有关。IL-1β在HT患者外周血中的表达增高，可能在HT的发病过程中起重要作用。

1石晓静,殷佩浩.桥本甲状腺炎的治疗研究进展〔J〕.世界中西医结合杂志,2014;9(10):1142-4.

2高莹,刘明明,修瑞娟.桥本甲状腺炎的免疫学发病机制进展〔J〕.内科理论与实践,2013;8(6):392-6.

3刘安宁，黄晶.覆盖本甲状腺炎患者外周血IL-14的表达及意义〔J〕.中国卫生检验杂志,2016;26(2):254-6.

4Esfahanian F,Ghelich R,Rashidian H,etal.Increased levels of serum interleukin-17 in patients with Hashimoto′s thyroiditis〔J〕.Indian J Endocrinol Metab,2017;21(4):551.

5Ruggeri RM,Saitta S,Cristani M,etal.Serum interleukin-23 (IL-23) is increased in Hashimoto′s thyroiditis〔J〕.Endocr J,2014;61(4):359-63.

6Yan C,Gao N,Sun H,etal.Targeting imbalance between IL-1β and IL-1 receptor antagonist ameliorates delayed epithelium wound healing in diabetic mouse corneas〔J〕.Am J Pathol,2016；186(6):1466-80.

7Li X,Tian F,Wang F.Rheumatoid arthritis-associated microRNA-155 targets SOCS1 and upregulates TNF-α and IL-1β in PBMCs〔J〕.Int J Mol Sci,2013;14(12):23910-21.

8雷洪涛,王筠,马淑骅,等.IL-1β、TNF-α与阿尔茨海默病的研究进展〔J〕.中国老年学杂志,2014;34(24):7115-7.

9陈宝琴,李实,张家玮.血清 TPOAb和TGAb 在桥本氏甲状腺炎和甲亢诊断中的意义〔J〕.中国实验诊断学,2015;19(11):1932-3.

10Tomisti L,Urbani C,Rossi G,etal.The presence of anti-thyroglobulin (TgAb) and/or anti-thyroperoxidase antibodies (TPOAb) does not exclude the diagnosis of type 2 amiodarone-induced thyrotoxicosis〔J〕.J Endocrinol Invest,2016;39(5):585-91.