秋梨膏对纳米二氧化硅引起大鼠肝、肾毒性的防护作用

陆　敏　孙湖泊　李　妍　王长文　

(吉林医药学院，吉林　吉林　132013)

1北京体育大学附属医院

纳米颗粒的粒径极小，可以顺利通过生物膜而进入机体的组织细胞，并进一步影响细胞内核酸、蛋白质和脂质等生物大分子的结构与功能，最终引起细胞代谢紊乱或基因表达异常〔1～3〕。Duan等〔4〕研究发现，纳米二氧化硅是诱发心血管疾病的危险因素；龚春梅等〔5〕进一步证实了纳米二氧化硅对机体的毒性作用。本实验拟检测纳米二氧化硅对大鼠肝、肾的影响及秋梨膏的干预效果。

1　材料与方法

1.1实验动物与分组健康雄性Wistar大鼠，体重(200±20)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物批准号为2011-x-072。随机将大鼠分为3组，每组8只，对照组采取灌胃生理盐水及气管滴注生理盐水处理；染毒组灌胃生理盐水，并给予气管滴注纳米二氧化硅，浓度10 mg·kg-1·bw-1；秋梨膏干预组在气管滴注纳米二氧化硅的同时，灌胃秋梨膏(0.225 ml/只)。每组大鼠均隔日气管滴注，共进行15次。非气管滴注日进行灌胃。处理结束后麻醉大鼠，并迅速取出肝及肾，称重并逐项检测。

1.2主要试剂秋梨膏，北京恩济堂制药有限公司生产；粒径50 nm的纳米二氧化硅购自阿拉丁生物制品有限公司；羟脯氨酸(HYP)试剂盒，南京建成生物工程研究所生产；转化生长因子(TGF)-β1抗体由美国Abcam生物科技公司提供；其他试剂均为国产分析纯。

1.3大鼠尿常规检测各组大鼠处死时从膀胱抽取尿液，检测尿隐血、亚硝酸盐、尿胆原、尿胆红素、尿葡萄糖等尿常规指标。

1.4肝、肾组织HYP含量检测准确称取肝、肾组织后，加入水解液中混匀，沸水浴水解，按照HYP含量测定试剂盒说明书进行操作，计算肝及肾组织中HYP含量。HYP的含量反映了组织中胶原纤维的含量，是特异性判断组织早期纤维化相关性的重要指标，Masson染色蓝染的部分即为胶原纤维。

1.5免疫组织化学染色采用免疫组织化学染色法检测肝、肾细胞中TGF-β1的表达情况。肝、肾组织切片后分别经过抗原修复后按照免疫组织化学染色步骤进行染色，使用光学显微镜观察切片。对照组细胞核呈蓝色且深染，而表达阳性细胞的胞质呈黄色或棕黄色，计数每个400倍视野下的阳性细胞数。

1.6统计学方法应用SPSS17.0软件进行χ2检验、t检验、单因素方差分析。

2　结　果

2.1大鼠尿常规指标检测硅染毒组大鼠尿隐血(6例)、尿胆原+(8例)、尿胆红素+(8例)明显高于对照组(均0例)，而秋梨膏干预可有效改善大鼠尿隐血(0例)及尿胆红素(+0例)异常现象，差异有统计学意义(P<0.01)，但秋梨膏对纳米二氧化硅染毒大鼠的尿胆原(+8例)升高没有缓解作用(P>0.05)。

2.2大鼠肝、肾组织苏木素-伊红(HE)染色结果显微镜下观察对照组大鼠的肝组织切片，可见肝细胞的形态正常，细胞膜及核膜完整，中央静脉形态正常。染毒组大鼠肝组织中可见淋巴细胞浸润，形成肉芽肿，肝细胞出现水样变性。与对照组大鼠肾组织相比，染毒组肾小管管腔因水肿而狭窄，肾小管上皮细胞发生水样变性，肾小球充血。秋梨膏干预组大鼠的肝、肾病理变化与对照组相比均明显减轻。见图1。

图1　秋梨膏对纳米二氧化硅染毒大鼠肝、肾组织形态的影响(HE，×400)

2.3HYP含量检测对照组、染毒组及秋梨膏干预组大鼠肝(103.57、92.52、86.22 μg/g)、肾(93.37、102.38、91.84 μg/g)HYP的含量变化差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图2　各组大鼠肝、肾Masson染色照片(Masson，×400)

2.4TGF-β1表达检测秋梨膏干预组大鼠肾组织中TGF-β1阳性细胞数(143.50个)明显高于对照组(1.50个)和染毒组(1.75个，P<0.01)，肝组织中(1.25个)与对照组(3.50个)和染毒组(0.75个)差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

图3　各组大鼠肝、肾TGF-β1表达的免疫组化照片(×400)

3　讨　论

细胞实验结果表明，纳米二氧化硅的粒径及细胞的种类是影响其毒性的关键因素〔6〕。Rabolli等〔7〕研究发现纳米二氧化硅颗粒对J774巨噬细胞、EAHY926 内皮细胞、3t3 纤维母细胞和人类红细胞的毒性作用机制及毒性效应并不相同。本研究结果表明，纳米二氧化硅可引起大鼠肝、肾细胞的明显水肿，提示一定粒径的纳米二氧化硅对肝肾组织均有损伤作用。

秋梨膏是我国一直广泛使用的传统药膳膏剂，其润肺止咳、清热化痰的效果受到广大人民群众的普遍认可，但秋梨膏的药理作用目前尚未完全阐明。本实验结果表明，秋梨膏可明显抑制大鼠尿隐血及尿胆红素异常增高现象，并明显缓解纳米二氧化硅对肝、肾组织的毒性作用，减轻肝肾细胞损伤。另外与对照组相比，毒组及秋梨膏干预组大鼠肝、肾组织中胶原纤维含量均未发生变化，这可能是因为纳米二氧化作用时间较短，并未引起病变组织中胶原纤维的代偿性增加。

TGF-β家族成员包括TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3。研究表明〔8〕，TGF-β在调节细胞生长、增殖、分化、凋亡、免疫等方面具有重要的生物学作用。其中，TGF-β1主要由内皮细胞和结缔组织产生，是组织损伤及器官修复过程中的核心调控分子。本实验结果说明给予秋梨膏可能诱导大鼠肾组织中TGF-β1信号转导分子的过量表达。本研究结果显示，纳米二氧化硅可引起大鼠肝、肾组织的明显损伤，秋梨膏可有效抑制纳米二氧化硅的毒性作用，但秋梨膏对纳米二氧化硅引起的肝、肾组织损伤调控机制有所不同，其具体的分子机制有待深入研究。

1Periasamy VS，Athinarayanan J，Akbarsha MA，etal.Silica nanoparticles induced metabolic stress through EGR1，CCND，and E2F1 genes in human mesenchymal stem cells 〔J〕.Appl Biochem Biotechnol，2015；175(2)：1181-92.

2Lin Z，Ma L，Zhuge X，etal.A comparative study of lung toxicity in rats induced by three types of nanomaterials 〔J〕.Nanoscale Res Lett，2013；8(1)：1-11.

3Lu CF，Yuan XY，Li LZ，etal.Combined exposure to nano-silica and lead induced potentiation of oxidative stress and DNA damage in human lung epithelial cells 〔J〕.Ecotoxicol Environ Saf，2015；122：537-44.

4Duan J，Yu Y，Yu Y，etal.Silica nanoparticles induce autophagy and endothelial dysfunction via the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway 〔J〕.Int J Nanomedicine，2014；5(9)：5131-41.

5龚春梅，杨亚蕊，周继昌，等.维生素E对纳米二氧化硅诱导人支气管上皮细胞损伤的保护作用 〔J〕.职业与健康，2016；32(7)：902-5.

6Sohaebuddin SK，Thevenot PT，Baker D，etal.Nanomaterial cytotoxicity is composition，size，and cell type dependent 〔J〕.Part Fibre Toxicol，2010；7(1)：22.

7Rabolli V，Thomassen LC，Princen C，etal.Influence of size，surface area and microporosity on the in vitro cytotoxic activity of amorphous silica nanoparticles in different cell types 〔J〕.Nanotoxicol，2010；4(3)：307-18.

8Scharf JG，Braulke T.The role of the IGF axis in hepatocarcinogenesis 〔J〕.Horm Metab Res，2003；35(11-12)：685-93.