大豆蛋白澄清剂对‘赤霞珠’干红葡萄酒品质的影响

鲁榕榕，马腾臻，张波，Antonio Morata，祝霞，韩舜愈*

1(甘肃农业大学 食品科学与工程学院，甘肃省葡萄与葡萄酒工程学重点试验室，甘肃省葡萄与葡萄酒产业技术研发中心，甘肃 兰州，730070)2(马德里理工大学 高等农业工程技术学院化学与食品技术系，西班牙 马德里)

澄澈外观、良好色泽及协调香气是优质红葡萄酒重要的感官品质。新酿制的葡萄酒中含有多酚、蛋白质等大分子物质，酒体浑浊或极不稳定，下胶澄清是指通过加入能够迅速沉降这些悬浮物的物质，使酒体在短时间内达到较好澄清度及稳定性的工艺操作[1-2]。常用的下胶材料主要分为天然凝胶、蛋白类下胶剂(包括动物和植物蛋白)和化学合成下胶剂三类[2]。皂土是最常用的天然凝胶下胶澄清剂，其澄清效果较好，但会与红葡萄酒中色素及香气物质结合，从而严重影响酒体色泽及风味品质，且使用前需提前用温水浸泡，处理后会使酒体产生大量酒脚，不便于生产操作[3]；化学合成的下胶澄清剂PVPP和酪蛋白酸钾等易溶解、使用方便，且PVPP可除去红葡萄酒中的劣质单宁，改善其感官品质，但也会对红葡萄酒的色泽有较大影响[4]；酪蛋白和明胶作为常用的动物蛋白类下胶澄清剂，能够与红葡萄酒中的单宁结合，降低酒体收敛性，提高柔和度，且对品质影响较小，但其可能会引起一些特殊人群的过敏反应，存在一定的安全隐患[4]。

植物蛋白类下胶澄清剂能够在很大程度上弥补传统澄清剂的这些缺陷，研究表明其在保证下胶质量的同时，对葡萄酒色泽及香气品质影响较小，具有较高安全性，还可用于严格素食主义者葡萄酒的生产[3, 5-6]。目前，已有部分学者对谷朊蛋白在葡萄酒中的应用进行了评价，如GONZáLEZ[7]研究了皂土、明胶、卵清蛋白和谷朊蛋白对新酿制和陈酿的红葡萄酒色泽及色素成分的影响，表明谷朊蛋白在新酒中的澄清效果优于动物蛋白，且其对酒样色泽品质影响较小；屈慧鸽[8]等关于‘蛇龙珠’干红葡萄酒的研究表明，谷朊蛋白具有较好的澄清效应，但过量添加会导致葡萄酒品质下降；然而HISCHENHUBER[9]研究发现谷朊蛋白可能会引起食物过敏和腹腔疾病等不良反应。

植物蛋白来源广泛、种类繁多，具有较大应用潜力，但目前报道的可用于葡萄酒下胶澄清的植物蛋白还较少，有待进一步开发。GRANATO等[5]研究了豆类蛋白(大豆蛋白、豌豆蛋白、扁豆蛋白)和谷朊蛋白4种植物蛋白澄清剂对白葡萄酒澄清效果的影响，结果表明大豆蛋白澄清效果不亚于谷朊蛋白，且对原花色素含量的影响较小，可用于白葡萄酒的澄清处理，但有关其在红葡萄酒中的应用以及对酒体色泽和香气品质影响的研究较少。

同国外优质红葡萄酒相比，我国西部产区存在醇香不足、色度较浅、色泽老化快等问题，这也是多年来一直制约当地干红葡萄酒品质提升的关键问题之一。因此，如何通过下胶澄清剂或澄清工艺的改良，减少生产过程中色素及香气成分的损失在实际生产中具有重要意义。本试验以甘肃农业大学自产的‘赤霞珠’干红葡萄酒作为试材，比较皂土、明胶、酪蛋白、大豆蛋白和聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)5种不同类型澄清剂的澄清效果及其对酒样基本指标、颜色、酚类物质及挥发性香气的影响，以期为红葡萄酒品质的调控与新型下胶澄清剂的推广应用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　材料与试剂

‘赤霞珠’葡萄于2015年采自甘肃农业大学葡萄种植基地，含糖量约为20.3～21.0 °Brix，并于2016年进行酿制。

酿酒酵母[红佳酿 Vintage Red(VR)]，意大利Enartis公司；大豆蛋白、皂土、酒酒球菌(OMEGA)、果胶酶(Cuvee Blanc)，法国Lallemand公司；酪蛋白、福林酚、2-辛醇(色谱纯)，美国Sigma公司；明胶、聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、磷钼钨酸显色剂及无水葡萄糖、一水合没食子酸等常规试剂，天津市光复精细化工研究所；费林试剂、次甲基蓝指示剂及酚酞指示剂等均按GB/T 603—2002.《化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备》进行配制。

1.2　仪器与设备

TRACE 1310气象色谱-质谱联用仪、ISQ型单四级杆质谱仪、Genesis 10S型紫外-可见分光光度仪，美国Thermo Scientific公司；色谱柱DB-WAX(60 m×2.5 mm×0.25 μm)，美国Agilent Technologies公司；固相微萃取(solid phase microextraction，SPME)装置、50/30 μm二乙基苯/碳分子筛/聚二甲基硅(divinylbenzene/carboxen/polydimethyl-siloxane，DVB/CAR/PDMS)萃取头，美国Surpelco公司；CP 214型电子分析天平，上海奥豪斯仪器有限公司；DF-II集热式恒温磁力搅拌器，金坛市恒丰仪器制造有限公司；160350D型沸点测定仪，法国DujardinSalleron公司；BCD-539WF型冰箱，青岛海尔股份有限公司；18100摩尔超纯水机，重庆摩尔水处理设备有限公司；HH-S型恒温水浴锅，金坛市恒丰仪器制造有限公司。

1.3　方法

1.3.1葡萄酒酿制

筛选适量品质较好且成熟度一致的‘赤霞珠’葡萄除梗破碎，添加50 mg/L SO2(以偏重亚硫酸钠形式)及200 mg/L果胶酶，低温浸渍48 h后，接种0.2 g/L酿酒酵母并于25～28 ℃下进行酒精发酵，至残糖低于4 g/L皮渣分离终止发酵(发酵时间约为12 d)，然后接种0.02 g/L酒酒球菌进行苹果酸-乳酸发酵(15～18 ℃，约14 d)，苹果酸低于0.5 g/L即完成发酵，进行两次倒罐去酒泥后，酒样在低温下密封贮存备用。

1.3.2下胶澄清试验

皂土和明胶用适量温水配制成100 g/L的溶液，浸泡膨胀12 h后，搅拌均匀备用；大豆蛋白、酪蛋白和PVPP则直接配制成100 g/L的溶液，用200 mg/L SO2保存备用[10]。

将酒样分装于250 mL透明玻璃瓶中，加入5种下胶澄清剂母液并调整其浓度统一分别为100、200、300 mg/L(通过预试验确定5种下胶澄清剂相同的有效浓度范围[10-11])，以自然澄清酒样作为对照，室温下避光静置两周后，记录瓶底酒泥厚度并进行相关检测，每个处理重复3次。

1.3.3基本指标测定

总酸：采用酸碱滴定法[12]，结果以酒石酸(g/L)计。

挥发酸：室温下，用特制蒸馏装置蒸馏10 mL酒样，收集馏出液以后，采用酸碱滴定法进行测定[12]，结果以乙酸(g/L)计。

总糖：采用斐林试剂法[12]，结果以葡萄糖(g/L)计。

酒精度：采用沸点测定仪测定。

透光率：利用紫外-可见分光光度计检测酒样在波长为680 nm处的透光率，以蒸馏水为对照[1]。

色度、色调：参照SIMONATO[13]方法，酒样用相同pH值的缓冲溶液稀释5倍后，分别测定其在波长为420、520、620 nm处的吸光度值，即A1、A2、A3，三者之和为酒样色度，前两者之比为色调。

单宁：参照NY/T 1600—2008 《水果、蔬菜及其制品中单宁含量的测定：分光光度法》[14](y=0.118 8x-0.000 7，R2=0.999 1)。

总酚：采用FOLIN-CIOCALTEN比色法[15]测定。将1 mL酒样用蒸馏水稀至100 mL后，取1 mL样品溶液加入蒸馏水5 mL、1 mol/L的FOLIN-CIOCALTEN显色剂1 mL和7.5%的Na2CO3溶液3 mL进行显色，静置2 h后，在765 nm波长处测定样品吸光度，再根据标准曲线方程(y=0.102 4x-0.005 8，R2=0.999 3)计算总酚含量。

花色苷：参照CHRIS[16]方法。取适量酒样于4 ℃，5 000 r/min离心10 min，然后进行后续操作。(1)用缓冲液将酒样稀释10倍后，测其在520 nm处吸光度，记为A520；(2)取100 μL酒样，加10 mL 1 mol/L的盐酸溶液，室温静置3～4 h后，测其在520 nm处吸光度，记为A520-H；(3)取2 mL酒样，加100 μL 6% 的NaHSO3溶液，混匀后立即测其在520 nm处吸光度，记为A520-S。总花色苷、单体花色苷、聚合花色苷和显色花色苷的含量分别按公式(1)、(2)、(3)、(4)进行计算：

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

(7)

柔和指数：参照张佳涛[17]方法，按公式(8)计算：

S=A-(T+C)

(8)

式中：S，样品柔和指数；A，乙醇体积分数，%；T，总酸含量，g/L；C，单宁含量，g/L。

蛋白质含量：采用考马斯亮蓝法[18]测定。取适量酒样离心，取1 mL上清液，加5 mL考马斯亮兰G250试剂，充分混合放置2 min后，于595 nm处测量吸光度，记录并通过标准曲线获得酒样中蛋白含量。

蛋白稳定性：参照POCOCK[19]方法，取200 mL经0.45 μm膜过滤酒样于80 ℃恒温水浴6 h后，4 ℃恒温冷却12 h，然后分别测定540 nm处加热前与冷却后的吸光度，若两者差值≤0.02，则样品稳定。

1.3.4挥发性香气成分的测定

1.3.4.1香气富集

取8 mL酒样于15 mL样品瓶中，加入2 g NaCl和100 μL内标2-辛醇(浓度为1.664 mg/L)，加转子密封，置于磁力搅拌器上，40 ℃下水浴平衡30 min后顶空萃取30 min。萃取结束后，取出萃取头插入GC-MS联用仪进行香气检测。

1.3.4.2GC-MS条件

参照陈霞[20]方法，并略作调整。

色谱条件：色谱柱：DB-WAX(60 m×2.5 mm×0.25 μm)；升温程序：40 ℃保持7 min，以4 ℃/min升至200 ℃，保持8 min；载气(He)流速1 mL/min；进样口温度240 ℃；不分流进样。

质谱条件：电子轰击离子源(EI)；电子能量70 eV；传输线温度220 ℃；离子源温度240 ℃；质谱扫描范围m/z50～350。

1.3.4.3香气成分分析

定性分析：采用保留指数(RI)和NIST-11、Wiley及香精香料谱库检索比对进行定性，谱库比对时要求匹配度大于800。

定量分析：采用内标法进行半定量分析，内标为2-辛醇。计算公式[21]如下：

(9)

式中：X，香气物质的质量浓度，mg/L；f，内标物的校正因子，f=1；A，测得香气物质的峰面积；c，内标物的质量浓度，mg/L；A0，测得内标物的峰面积。

1.4　数据处理

利用Microsoft Office Excel 2013对样本(n=3)所得数据进行基本处理，IBM SPSS Statistics 19.0分析软件进行数据的统计分析。其中，采用多因素方差分析(Duncan法)(p<0.05)进行数据的差异显著性分析，并对不同处理酒样的香气化合物进行主成分分析。

2　结果与分析

2.1　澄清剂对红葡萄酒澄清效果及基本指标的影响

2.1.1澄清效果

图1表示不同下胶澄清处理后酒样透光率变化及其酒脚厚度。如图所示，与对照相比，下胶澄清后大多数酒样的澄清度显著提高(p<0.05)，且随澄清剂用量的增加，澄清度呈上升趋势(大豆蛋白除外)，但酒脚厚度也逐渐增加。图1-A中，透光率达到91%以上的酒样包括200 mg/L和300 mg/L的PVPP、大豆蛋白和明胶处理组。其中，PVPP 300 mg/L和大豆蛋白200 mg/L 处理酒样的透光率较高，200 mg/L和300 mg/L明胶处理组次之，且两者无显著差异(p>0.05)；但300 mg/L PVPP会使酒体产生大量酒脚，不利于后续生产操作。此外，100 mg/L的皂土和酪蛋白几乎无澄清作用，但当用量为200 mg/L时，酒样澄清度显著提高，且300 mg/L皂土处理组澄清度显著高于200 mg/L，而200 mg/L和300 mg/L的酪蛋白处理酒样无显著差异(p>0.05)。

2.2.2澄清剂对酒样基本指标的影响

由表1可知，与对照相比，除B1、P3、S1和S2处理组酒精度有所降低(降低0.16%～0.24%)，其他酒样无显著变化，说明澄清剂对酒精度几乎无影响。经下胶澄清处理酒样的总酸和总糖含量分别降低-0.01～0.12 g/L和0～0.45 g/L，挥发酸含量上升0～0.06 g/L，但大多数酒样与对照差异不显著。其中，酪蛋白处理酒样的总酸含量显著降低(降低5.62%～6.82%)，而明胶对总糖有较大影响(降低11.47 %～22.73%)。不同澄清剂对葡萄酒的柔和度有不同影响，其中B2、B3和L3处理酒样的柔和指数显著提高，而S1处理组则显著下降(p<0.05)。此外，蛋白类澄清剂(酪蛋白、大豆蛋白和明胶)处理酒样中，蛋白残留量与对照组差异不显著，未超过葡萄酒中蛋白允许最大量[3]，且酒体蛋白稳定性也未受到显著影响(明胶300 mg/L除外)；而皂土会显著降低酒样中蛋白质含量(p<0.05)，从而提高其稳定性(表1)。

表1　各处理酒样的基本指标Table 1　Basic indexes of different fined sample wine

注：处理列中B、C、P、S、G、CK分别表示皂土、酪蛋白、PVPP、大豆蛋白、明胶处理组及对照组，1、2、3分别表示用量为100、200、300 mg/L；

表中同一指标内不同字母代表差异显著，样本量n=3，p< 0.05；下同。

2.2　澄清剂对红葡萄酒色泽及酚类物质的影响

如表2，经下胶澄清处理酒样的色度值均低于对照酒样，且随澄清剂浓度的增加呈递减趋势，尤其300 mg/L处理组色度显著较低(降低12.75%～27.63%)。其中，PVPP、大豆蛋白和明胶处理酒样的澄清度虽相对较高，但PVPP和明胶对酒样色度影响较大(P3和G3与对照相比降低27.63%)，而大豆蛋白的影响相对较小(仅降低5.66%～12.75%)。此外，B3酒样的色调值明显上升，而其他处理组与对照差异不显著(C3和P3除外，p>0.05)。

各处理酒样的颜色变化主要与其多酚化合物变化有关。与对照相比，澄清处理酒样的总酚含量均有所下降，且随用量的增加而逐渐降低，尤其皂土处理组降低4.76%～13.94%(表2)。花色苷是与红葡萄酒颜色相关的主要酚类物质，下胶澄清后酒样中总花色苷与单体花色苷含量均有所降低，且随澄清剂用量的增加呈下降趋势(G3除外)。其中，C1和D1处理组的总花色苷仅减少4.38 mg/L和0.91 mg/L，PVPP和明胶处理组的总花色苷则下降较多(降低20.44～46.46 mg/L)，而B1、C1和S1酒样中单体花色苷含量与对照相比反而有所上升。处理组聚合花色苷含量显著低于对照组(p<0.05)，其中PVPP和明胶处理酒样下降16.02%～39.68%。就显色花色苷含量而言，澄清度较高的处理组(PVPP、大豆蛋白和明胶)低于澄清度较低处理组(皂土和酪蛋白)，其中， PVPP处理酒样中显色花色苷下降最多(P2和P3分别降低41.44%和37.31%)，而明胶和大豆蛋白对其影响相对较小(降低2.54%～14.47%)。此外，下胶澄清后酒样中单宁含量也有所降低，尤其皂土处理酒样中下降4.76%～30.20%，这也是其柔和指数显著提高的原因。

表2　各处理酒样的色度、色调及酚类物质含量Table 2　Color intensity, hue and content of phenolic compound in different fined sample wine

2.3　澄清剂对红葡萄酒挥发性香气的影响

2.3.1各处理酒样香气成分的GC-MS分析

结合以上分析结果，试验采用HS-SPME-GC-MS法对200 mg/L处理酒样的挥发性香气化合物进行了检测分析。如表3，共检出85种香气物质，包括24种酯类(约占香气总量34.25%～38.94%)、29种醇类(45.84%～51.97%)、11种有机酸类(8.87%～10.84%)、9种萜烯类(2.30%～2.84%)、5种羰基类(0.59%～1.19%)及7种其他化合物(0.68%～1.07%)。不同处理酒样的香气物质种类及含量有所差异：与对照相比，处理组中均未检出乙酸松油酯、乙酸苯乙酯和6-甲基辛烯，但额外检出邻甲酚；而皂土处理组香气总量降低28.83%，大豆蛋白处理组则仅降低10.28%，其他酒样介于两者之间，其中PVPP和酪蛋白处理组差异不显著(p>0.05)。

表3　各处理酒样中挥发性香气化合物的GC-MS分析Table 3　GC-MS analysis of volatile compounds in different fined sample wine

续表3

序号香气化合物RI(DB-WAX)含量/(mg·L-1)对照对照大豆蛋白PVPP明胶酪蛋白皂土气味描述72-己烯酸乙酯12450.43±0.040.36±0.020.35±0.070.39±0.050.36±0.070.45±0.058辛酸乙酯143425.81±0.52a25.47±1.12a23.12±0.06ab20.66±0.21b24.47±0.40a22.81±0.56ab果香、油脂味[23]9壬酸乙酯15301.27±0.081.13±0.061.15±0.15ndndnd哈密瓜、草莓香[24]10乳酸异戊酯15640.59±0.050.42±0.030.53±0.100.51±0.060.46±0.060.55±0.0911癸酸乙酯163817.53±0.19a16.51±1.80ab15.36±0.19bc10.60±1.02d16.51±0.45ab14.62±0.57c脂肪味、果香[24]12辛酸-3-甲基丁酯16570.69±0.030.63±0.070.65±0.100.25±0.090.47±0.030.58±0.0313乙酸松油酯16850.45±0.02ndndndndnd柠檬、薰衣草香[25]149-癸烯酸乙酯16976.12±0.22ab6.55±0.41a5.47±0.39b4.54±0.22c5.89±0.21ab5.90±0.51ab果香[22]15苯乙酸乙酯17450.10±0.02ndndndndnd蜂蜜香[20]16水杨酸甲酯17511.28±0.041.19±0.111.27±0.211.20±0.131.43±0.091.36±0.11冬青叶香[26]17乙酸苯乙酯18132.85±0.022.64±0.022.72±0.382.47±0.182.54±0.102.77±0.17玫瑰、茉莉花香[20]18月桂酸乙酯18414.01±0.03a4.06±0.55a4.02±0.13a3.94±0.21a2.96±0.26b2.91±0.22b甜香、蜂蜡香[22]19花生四烯酸甲酯.21±0.030.14±0.040.21±0.06nd0.17±0.040.20±0.02202,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二异丁酸酯.44±0.050.32±0.090.25±0.060.21±0.080.21±0.030.45±0.0721肉豆蔻酸乙酯20400.16±0.02b0.15±0.04bc0.16±0.03bc0.25±0.04a0.11±0.03cd0.07±0.01d椰子、蜂蜡香[20]223-羟基十三烷酸乙酯.21±0.020.20±0.040.18±0.050.19±0.040.16±0.040.15±0.0323棕榈酸乙酯22480.36±0.06a0.25±0.03bc0.24±0.04c0.34±0.06ab0.29±0.06abc0.34±0.04ab脂肪味、水果味[20]24丁二酸单乙酯.32±0.060.15±0.070.23±0.110.16±0.020.27±0.040.26±0.04合计/(mg·L-1)111.84±0.78a106.57±1.17b99.29±0.56c86.83±1.17e100.40±0.35c91.92±1.97dB醇类1异丁醇10983.54±0.04a3.16±0.39ab3.59±0.36a2.76±0.18bc2.52±0.49c1.84±0.38d溶剂味、生青味[27]2正丁醇11450.30±0.02a0.14±0.05c0.28±0.04a0.17±0.01bc0.21±0.03b0.18±0.01bc草药、醇味[20]3正戊醇125166.38±0.81a66.21±1.75a61.81±0.85b64.02±3.01ab62.45±1.13b42.78±0.41c辛辣味、青草香[20]44-甲基-1-戊醇13060.26±0.020.23±0.030.16±0.040.16±0.010.19±0.020.23±0.0952-庚醇13160.20±0.050.18±0.050.14±0.040.15±0.030.15±0.040.18±0.04葡萄、柠檬香[20]63-甲基-1-戊醇13180.91±0.080.94±0.180.76±0.040.79±0.090.88±0.080.97±0.23刺激溶剂、生青味[20]7正己醇135315.55±0.49a14.71±1.26ab13.36±0.86b14.34±0.81ab14.33±0.89ab15.29±0.44a草本植物、青草味[20]8叶醇13701.51±0.071.43±0.130.85±0.120.94±0.110.88±0.171.15±0.17青草味[23]91-辛烯-3-醇14472.96±0.11nd0.33±0.060.18±0.01ndnd蘑菇香[20]10庚醇14492.60±0.23a1.97±0.27b2.19±0.19ab1.93±0.17b2.17±0.36ab2.41±0.30ab油脂气息[27]112-乙基己醇14900.36±0.020.31±0.03nd0.34±0.03ndnd甜香、花香[22]124-甲基-3-乙基戊醇15070.45±0.04nd0.18±0.030.23±0.060.36±0.030.28±0.02132-壬醇15200.75±0.060.54±0.040.46±0.040.50±0.100.59±0.040.70±0.0814正辛醇15551.10±0.05a0.94±0.16a1.05±0.04a1.01±0.15a0.98±0.13a1.01±0.18a刺激的芳香气味[26]152,3-丁二醇15561.67±0.071.57±0.131.19±0.071.50±0.031.30±0.121.67±0.25黄油、乳酪香[22]166-甲基-1-辛醇.98±0.100.76±0.060.92±0.110.66±0.080.83±0.060.87±0.1317糠醇16540.84±0.040.68±0.160.71±0.070.62±0.05nd0.60±0.03烤面包味、焦糖味[23]181-壬醇16582.77±0.04a2.41±0.29ab2.69±0.25a2.17±0.31b2.15±0.35b2.39±0.22ab水果、蔷薇香[20]193-壬烯醇16820.41±0.030.29±0.050.33±0.040.24±0.030.25±0.030.27±0.04206-壬烯醇17150.59±0.010.49±0.090.56±0.040.45±0.020.40±0.060.48±0.04212-十一烷醇1717nd0.19±0.020.15±0.03nd0.09±0.060.10±0.03223,6-壬二烯-1-醇.13±0.010.09±0.020.10±0.05ndnd0.08±0.0123癸醇17530.39±0.030.31±0.050.33±0.020.20±0.010.25±0.030.36±0.03橙花香、油脂味[26]244-癸烯醇17840.27±0.010.23±0.020.27±0.040.21±0.050.24±0.050.24±0.03252-丁基-1-辛醇18550.80±0.02ndndnd1.59±0.25nd26苄醇18683.13±0.132.70±0.172.85±0.442.79±0.402.74±0.372.56±0.34花香[28]27苯乙醇190938.40±1.78a31.41±0.69bc31.61±0.83bc33.58±0.32b31.16±1.53c30.86±1.37c玫瑰、花香、甜香[24]28月桂醇19671.25±0.030.52±0.040.43±0.121.20±0.020.36±0.090.36±0.0729棕榈醇23860.25±0.10ndnd0.22±0.04ndnd脂肪味[25]合计/(mg·L-1)149.21±1.82a132.70±1.18b128.33±0.44cd131.75±3.71bc126.04±2.61d108.19±2.54e

续表3

注：nd表示未检出该香气成分， 表示未查到相关资料。

与对照相比(111.84 mg/L)，下胶澄清后酒样中酯类物质含量均有显著下降，由高到低依次为：大豆蛋白(106.57 mg/L)、酪蛋白(100.40 mg/L)、PVPP(99.29 mg/L)、皂土(91.92 mg/L)和明胶(86.83 mg/L)。其中，大豆蛋白和酪蛋白对乙酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯和9-癸烯酸乙酯等含量较高酯类无显著影响(降幅为3.34%～8.76%)；而明胶影响较大(降低15.28%～34.80%)，尤其癸酸乙酯降低65.37%。此外，皂土处理组中月桂酸乙酯和肉豆蔻酸乙酯含量显著最低(p<0.05)。

不同类型下胶澄清剂对葡萄酒中醇类香气的影响不同。蛋白类澄清剂处理酒样中，大豆蛋白和明胶处理组醇类物质含量分别为132.70 mg/L和131.75 mg/L，显著高于酪蛋白处理组(126.04 mg/L)；而皂土对醇类化合物影响最显著(与对照相比降低37.91%)。醇类香气中，正戊醇、正己醇和苯乙醇贡献较大，赋予了葡萄酒草香和花香，其中明胶对苯乙醇(花香)影响较小，大豆蛋白和皂土分别对正戊醇(草香)和正己醇(草香)无显著影响，但皂土对正戊醇和苯乙醇的影响最显著。此外，大豆蛋白显著降低了酒样中正辛醇(刺激性气味)的含量(p<0.05)。

酪蛋白和大豆蛋白对有机酸有较大影响(分别降低19.82%和14.50%)，而皂土、PVPP和明胶影响相对较小(降低11.57%～12.72%)，且三者无显著差异。其中，酪蛋白处理组中月桂酸(23.66 mg/L)与对照(28.35 mg/L)相比显著降低，其他4种澄清剂则无显著影响。另外，下胶澄清后酒样中萜烯类化合物均显著下降，其中明胶处理组萜烯物质含量(5.73 mg/L)显著低于PVPP和大豆蛋白处理组(6.98 mg/L和6.70 mg/L)(p<0.05)。

2.3.2各处理酒样挥发性香气的主成分分析

由于葡萄酒香气成分复杂多样，且不同处理间香气物质的种类及含量有所差异，因此可通过主成分分析(Principal component analysis，PCA)这种多元统计分析方法进行降维，而后研究各处理酒样的香气变化并对其品质进行综合评价[29]。以特征值大于1为依据，共提取5个公因子，其中，PC1、PC2和PC3的累计方差贡献率为78.65%，基本可以解释原变量大多数的变异信息。

a-PC1-PC2； b-PC1-PC3；c-样品分布图图2　香气化合物主成分分析的因子载荷图Fig.2　Loadings plot and score plot from PCA of volatilearoma compounds

载荷系数反映原始变量与主成分间的相关性，即初始变量在降维后因子中的贡献率大小[30]。由图2(a、b)可知，PC1主要反映了乙酸松油酯、乙酸苯乙酯、1-辛烯-3-醇、3-壬烯醇、芳樟醇和9-癸烯酸等香气化合物的变异信息(载荷系数>0.8)，乙酸和邻甲酚则与PC1呈高度负相关；PC2主要体现了乙酸异戊酯、月桂酸乙酯和肉豆蔻酸乙酯等物质，水杨酸甲酯和乙酸己酯在PC2上的载荷系数则为负；而PC3主要由棕榈酸乙酯、月桂酸、2-己烯酸乙酯(正相关)和2-十一烷醇(负相关)所贡献。

图2(c)为主成分分析的样品分布图，如图所示，大豆蛋白和PVPP处理组与对照组可聚为一类，其PC1和PC2得分均高于平均水平，但前两者PC3得分较低，说明大豆蛋白和PVPP处理酒样中乙酸异戊酯、月桂酸乙酯和肉豆蔻酸乙酯、1-辛烯-3-醇、3-壬烯醇和芳樟醇含量最接近对照组，而棕榈酸乙酯、月桂酸和2-己烯酸乙酯含量低于其他处理组。明胶处理组的PC1得分最低，PC2和PC3得分最高，说明明胶对其他香气物质影响较大，但对乙酸、棕榈酸乙酯、月桂酸和2-己烯酸乙酯等无太大影响。此外，皂土处理组的PC2得分最低，但PC3得分较高；而5种澄清剂中，酪蛋白对酒样挥发性香气化合物的影响居中。

3　讨论

3.1　澄清剂对葡萄酒澄清效果及理化指标的影响

下胶澄清后葡萄酒透光率显著提高，且随澄清剂用量的增加呈上升趋势，但酒脚厚度也逐渐增加。SIMONATO[13]等采用谷朊蛋白和明胶对赤霞珠和美乐红葡萄酒进行下胶澄清，处理后酒样浊度随澄清剂浓度增加逐渐降低，主要是由于澄清剂会与蛋白质和多酚化合物等大分子悬浮物结合形成沉淀，从而提高酒体澄清度及稳定性[31]。各处理组中，PVPP、大豆蛋白和明胶处理酒样澄清度较高。GRANATO[5]研究表明植物蛋白类澄清剂的澄清效果不次于常规澄清剂，且处理后酒样中蛋白残留量无显著变化，稳定性也较好，与本试验结果一致。此外，下胶澄清处理组的酒精度无明显变化，总糖和总酸含量略有下降，挥发酸略有增加，与屈慧鸽[8]研究结果基本一致；而大多数酒样的柔和度有所提高，这主要与澄清剂对单宁的影响有关，MARCHAL[32]也表明澄清剂可通过与单宁结合来改善葡萄酒的感官品质。

3.2　澄清剂对葡萄酒色泽及酚类物质的影响

澄清剂可通过与葡萄酒中大分子物质的结合来提高酒体澄清度和稳定性，但其与多酚化合物的相互作用也会影响葡萄酒的色泽感官品质[7]。下胶澄清后酒样色度显著降低，且随澄清剂用量增加呈明显下降趋势，与屈慧鸽[8]关于‘蛇龙珠’干红葡萄酒下胶澄清处理的研究结果一致，主要原因是澄清剂会吸附葡萄酒中的色素成分从而影响酒体颜色[7]。不同澄清剂对酒样色度和色调影响不同，SIMONATO[13]表明植物蛋白类澄清剂对酒样色度和色调几乎无影响，而COSME[3]关于白葡萄酒下胶澄清的研究也表明大豆蛋白对色度的影响小于PVPP，与本试验结果相同。皂土处理酒样的色调显著上升，可能是由于皂土对红葡萄酒红色色调的影响大于其对黄色色调的影响，与GONZáLEZ[7]结果一致。

多酚化合物是葡萄的重要次级代谢产物和主要生物活性成分，其对所酿葡萄酒的感官品质有重要作用，如花色苷和单宁分别与红葡萄酒颜色和收敛性有关[33]。下胶澄清后酒样中总酚含量均有所下降，与GONZáLEZ[7]研究结果一致，且随澄清剂用量的增加总酚含量逐渐降低，这与不同浓度梯度的皂土和谷朊蛋白处理后‘蛇龙珠’干红葡萄酒中总酚含量的变化趋势相同[8]。其中，处理组总花色苷和单宁含量均低于对照组，且其变化趋势与总酚相同，与OBERHOLSTER[34]研究结果较一致。值得注意的是，B1、C1和S1处理酒样中单体花色苷反而高于对照组，可能是由于澄清剂对聚合花色苷具有一定解聚作用，从而导致酒样中单体花色苷含量上升[34-35]，有待进一步验证。此外，澄清度较高酒样中，PVPP处理组的显色花色苷含量显著低于大豆蛋白和明胶处理组，这也与3组酒样的色度差异基本一致，关于下胶澄清剂对红葡萄酒色素成分的具体影响还有待研究。

3.3　澄清剂对葡萄酒挥发性香气的影响

酯类物质是葡萄酒中主要的一类挥发性芳香物质，是酵母发酵的副产物[21]。处理组中酯类物质含量均显著低于对照组，其中明胶对乙酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯和9-癸烯酸乙酯等含量较高的、香气特征为果香的低分子量酯类影响显著；皂土对月桂酸乙酯和肉豆蔻酸乙酯等具油脂气味的长链酯类影响较大；而大豆蛋白对酯类香气化合物的影响相对较小，这可能与其理化性质及结构有关。然而，由于商业制备大豆蛋白的工艺及成分不详，且其反应机理尚未见文献报道，因此有待进一步分析研究。此外，MOIO[36]研究也表明不同澄清剂对葡萄酒香气的影响过程较为复杂，其对不同类型香气物质也会有不同影响，这主要与澄清剂的物理化学性质、目标香气化合物的化学结构及两者间的物化反应有关。高级醇是酵母酒精发酵过程中氨基酸或糖代谢的产物，其含量受发酵条件、醪液理化指标及原料等因素的影响[25]。不同澄清剂对葡萄酒中醇类香气的影响不同，大豆蛋白和明胶处理组醇类物质含量显著高于酪蛋白处理组，这与GRANATO[5]等研究结果一致，即蛋白类澄清剂澄清效果较好，但由于分子间的相互作用，其对葡萄酒发酵型香气化合物的含量有不同影响。其中，苯乙醇是葡萄酒中具浓郁花香且阈值较低的典型醇类香气[24]，明胶对其影响较小，而皂土对其影响显著。此外，大豆蛋白显著降低了葡萄酒的刺激性气味。

大多数有机酸(如丁酸、羊脂酸和癸酸)都具有腐臭味，酪蛋白和大豆蛋白处理能够明显降低葡萄酒中这类不良气味，DUFOUR[37]研究也表明下胶澄清处理能够调整和改善酒体香气品质。此外，萜烯类化合物是葡萄酒品种香气的主要贡献者，也是其重要的特征香气物质[21]。GRANATO[5]等关于Catalanesca白葡萄酒的研究表明，与其他常用澄清剂相比，植物蛋白类澄清剂对葡萄酒的香气特征影响较小，与本试验结果较一致。

4　结论

(1)当大豆蛋白、皂土、明胶、酪蛋白和PVPP添加量为200 mg/L时，酒样透光率高，酒脚相对较少，酒精度和总糖基本无显著变化(p>0.05)，总酸含量略有降低，挥发酸略增，酒体柔和度有所提高。

(2)下胶澄清后酒样色度值均有所降低(尤其300 mg/L处理组)，色调基本无显著变化，其中PVPP和明胶对酒样色度有较大影响。

(3)处理组总酚、单宁、总花色苷、单体花色苷、聚合花色苷和显色花色苷含量均低于对照组，且随澄清剂浓度的增加均呈下降趋势(聚合花色苷除外)。其中，皂土对酒样总酚和单宁含量影响最大，而PVPP和明胶对总花色苷有较大影响。

(4)不同澄清剂处理后酒样香气成分的种类及含量不同，大豆蛋白对香气物质的影响最小，尤其是酯类成分。

(5)200 mg/L大豆蛋白处理后酒样的澄清度高，色泽良好且香气浓郁丰富，可用于‘赤霞珠’干红葡萄酒的下胶澄清。

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