粪肠球菌Enterococcus faecalis EC-12的万古霉素耐药基因检测

刘洋，张欣，陈建国，梁寒峭，程池*，伊地知 哲生，大盛 達也

1(中国食品发酵工业研究院，中国工业微生物菌种保藏管理中心，北京，100015)2(日本 Combi株式会社，埼玉，3380832)

粪肠球菌Enterococcusfaecalis分类学上归属乳杆菌目(Lactobacillales)，肠球菌科(Enterococcaceae)，肠球菌属(Enterococcus)[1]，是人和动物肠道内常见菌之一，具有耐酸、耐热、肠道黏附能力强等特点，以及具有抑制病原菌、增强免疫力等作用。粪肠球菌作为一种益生菌，被纳入益生菌 IDF 455-2012名单中，在医药和食品工程领域得到广泛应用[2]。粪肠球菌EC-12是日本Combi株式会社多年研制成功的一款灭活型乳酸菌，畅销日本二十多年。科学研究表明，灭活后的EC-12具有增强免疫力、调理肠道菌群、改善便秘、抑制花粉症、抗肿瘤等作用[3-7]。

粪肠球菌Enterococcusfaecalis虽然对维护肠道内环境起着不可忽视的作用，但是在特定条件下也会引起机体发生疾病，且粪肠球菌往往产生耐药性，已引起国内外医学、食品、饲料等行业的重点关注。其中粪肠球菌Enterococcusfaecalis对万古霉素的耐药性一直是研究热点之一。万古霉素耐药基因主要包括vanA、vanB和vanC。vanA、vanB为介导万古霉素高水平耐药的获得性耐药基因，且具有耐药基因转移的风险。VanA型是肠球菌中最常见耐药型，VanC型属于固有耐药性，耐药基因位于细菌染色体[8]。此外也有报道vanD, vanE和 vanG型等万古霉素耐药肠球菌，但这些基因型菌株并不常见[9-11]。

耐万古霉素肠球菌(Vancomycin-resistant Enterococcus，VRE)的检测方法主要有纸片扩散法、肉汤稀释法、琼脂筛选法和分子生物学等方法[12-13]。本研究利用PCR方法，对粪肠球菌EC-12进行万古霉素vanA、vanB、vanC以及vanD、vanE和vanG耐药基因进行特异性靶向检测，了解其是否携带耐药基因及其类型，评价其在万古霉素耐药基因水平上的安全性。

1　材料与方法

1.1　菌株

1.1.1对照菌株

屎肠球菌EnterococcusfaeciumCICC 24252(携带vanA基因)、粪肠球菌EnterococcusfaecalisCICC 24243(携带vanB基因)、鸡肠球菌EnterococcusgallinarumCICC 24240(携带vanC1基因)、铅黄肠球菌EnterococcuscasseliflavusCICC 24239(携带vanC2/3基因)和粪肠球菌EnterococcusfaecalisCICC 23530(阴性对照菌)，上述菌株均由中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)提供。

1.1.2样品菌株

粪肠球菌EnterococcusfaecalisEC-12，由日本Combi株式会社提供的灭活型菌粉。

1.2　主要仪器和试剂

PCR仪，德国Biometra；电泳仪，美国BIO-RAD；MRS培养基，北京陆桥技术股份有限公司；细菌基因组提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司； PCR MasterMix和DL 2000 Marker，北京全式金生物技术有限公司；PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。测序由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成。

1.3　方法

1.3.1DNA提取

对照菌株经MRS培养基，37 ℃培养24 h后，用细菌基因组提取试剂盒提取获得DNA。取0.1 g菌株EC-12的冻干菌粉，用1.0 mL TE缓冲液溶解，再取0.2 mL混合液用细菌基因组提取试剂盒提取获得DNA。

1.3.2PCR反应体系及条件

反应体系： 2×Mix 12.5 μL，上下游引物各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，补充ddH2O至25 μL。空白对照模板以1.0 μL ddH2O代替。

反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min, 54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min ，共30 个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

1.3.3引物选择

选择万古霉素耐药基因型保守基因(vanA、vanB、vanC1、vanC2/C3)的多对特异性引物进行PCR试验， 最终选用能够扩增出相应特异性条带，且不同产物条带大小能够区分的引物作为本方法检测vanA、vanB、vanC1、vanC2/C3型耐药基因的特异引物。另外，参照DEPARDIEU F等人的方法[16]，PCR检测样品菌株的vanD、vanE和vanG型耐药基因。PCR方法选用引物详见表1。

表1　PCR引物及扩增片段长度Table 1　Specific PCR primers and length of amplified fragments

1.3.4电泳检测

取PCR产物8 μL点样于1.5%的琼脂糖凝胶上，设置电泳参数：电压120 V， 时间25 min。电泳结束后放置凝胶成像系统紫外照射成像。

1.3.5阳性对照菌株的鉴定及耐药类型的确认

阳性对照菌株分别PCR扩增相应的万古霉素耐药基因，电泳检测是否扩增出单一的目的条带，同时对阳性条带进行测序，获得的序列提交至GenBank，并与NCBI中万古霉素耐药基因序列进行BLAST相似性比对，确认耐药基因类型。同时利用16S rRNA和pheS基因[17]对阳性对照菌株进行分子生物学鉴定，明确其分类名称。

1.3.6EC-12耐药基因检测

应用建立的PCR方法对样品菌株EC-12进行万古霉素耐药基因检测。

2　结果

2.1　对照菌株PCR检测及测序鉴定结果

万古霉素耐药基因检测显示，CICC 24 252扩增vanA基因阳性，电泳检测清晰可见1 030 bp单一条带，与vanA基因序列的相似性为99%。CICC 24 243扩增vanB阳性，电泳检测清晰可见536 bp单一条带，与vanB基因序列的相似性为99%。CICC 24 240扩增vanC1基因阳性，电泳检测清晰可见822 bp单一条带，经测序比对，与vanC1基因序列的相似性为99%。CICC 24 239扩增vanC2/3基因阳性，电泳检测清晰可见484 bp单一条带，经测序比对，与vanC2/3基因序列的相似性为99%。因此，利用万古霉素耐药基因特异引物，4株阳性菌株分别携带4种类型耐药基因，引物特异性、灵敏度良好，可以用于万古霉素耐药基因检测用阳性质控菌。16S rRNA结合pheS基因分析表明，CICC 24 252为屎肠球菌Enterococcusfaecium，CICC 24 243为粪肠球菌Enterococcusfaecalis，CICC 24 240为鸡肠球菌Enterococcusgallinarum，CICC 24 239为铅黄肠球菌Enterococcuscasseliflavus。基因序列登陆号及鉴定结果见表2。

表2　阳性对照菌株测序确认结果Table 2　Sequencing and identification results of the positive control strains

2.2　EC-12的耐药基因检测结果

如图1、图2所示，阳性对照菌株均能扩增出相应的耐药基因序列，EC-12的vanA、vanB、vanC1、vanC2 /C3、vanD、vanE和vanG基因扩增均为阴性。

M-D2000 Marker; S-EC-12; N-CICC 23530(阴性对照菌); C-空白对照; P1-CICC 24252(vanA阳性对照菌);P2-CICC 24243(vanB阳性对照菌);P3-CICC 24240(vanC1阳性对照菌); P4-CICC 24239(vanC2/3阳性对照菌)图1　样品菌株EC-12 DNA的耐药基因(vanA、vanB、vanC1和vanC2/C3)扩增电泳图谱Fig.1　Specific amplified results of vancomycin resistant genes (vanA,vanB,vanC1 and vanC2/C3) from strain EC-12

M-D2000 Marker; S-EC-12; N-CICC 23530(阴性对照菌); C-空白对照图2　样品菌株EC-12 DNA的耐药基因(vanD、vanE和vanG)扩增电泳图谱Fig.2　Specific amplified results of vancomycin resistantgenes (vanD, vanE and vanG) from strain EC-12

3　讨论

人们对肠球菌的利用以粪肠球菌和屎肠球菌为主，其安全及益生特性被越来越多的研究所证实[18-19]。国内畅销的许多微生态制剂组方中包含了粪肠球菌和屎肠球菌，例如妈咪爱和美常安(枯草芽孢杆菌和屎肠球菌)、思连康和普乐拜耳(婴儿双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌和蜡样芽孢杆菌)等。而在食品工程领域，以日本Combi株式会社研制的粪肠球菌EnterococcusfaecalisEC-12应用最为广泛。

耐万古霉素肠球菌通常出现在临床领域，随着万古霉素等抗生素的使用，菌株的获得性耐药和耐药程度不断提高，WHO已将万古霉素耐药肠球菌列为高度耐药性病原菌。对万古霉素肠球菌的检测目前主要集中在医学感染性肠球菌，对食品用途或益生性肠球菌的耐药基因检测鲜有研究。而本研究以粪肠球菌EnterococcusfaecalisEC-12为材料，采用PCR方法对EC-12的万古霉素耐药基因进行了筛查，结果显示其vanA、vanB、vanC1、vanC2/C3、vanD、vanE和vanG基因扩增均为阴性，体现其在主要万古霉素耐药基因水平上的安全性。

综上，目前肠球菌在国内外医药、食品工程、饲料工业等行业得到广泛应用，但肠球菌存在耐药性的风险较大，应加强医学、食品及饲料用肠球菌的耐药性检测，科学评价其安全性，保障肠球菌制品的安全性。

[1]SCHLEIFER K H, KILPPERBLZ R. Transfer ofStreptococcusfaecalisandStreptococcusfaeciumto the genusEnterococcusnom. rev. asEnterococcusfaecaliscomb. nov. andEnterococcusfaeciumcomb. nov.[J]. International Journal of Systematic Bacteriology, 1984, 34(1):31-34.

[2]BOURDICHON F , BERGER B , CASAREGOLA S, et al. Safety demonstration of microbial food cultures in fermented food products[J]. Bulletin of the International Dairy Federation, 2012,455:7-8.

[3]MIYAMOTO S, KOMIYA M, FUJII G,et al. Preventive effects of heat-killedEnterococcusfaecalisstrain EC-12 on mouse intestinal tumor development[J]. Int J Mol Sci, 2017, 18(4):826.

[4]NISHIBAYASHI R, INOUE R, HARADA Y, et al. RNA ofEnterococcusfaecalisstrain EC-12 Is a major component inducing interleukin-12 production from human monocytic cells[J]. PLoS One, 2015,10(6):e0129806.

[5]TSURUTA T1, INOUE R, NAGINO T,et al. Role of the mannose receptor in phagocytosis ofEnterococcusfaecalisstrain EC-12 by antigen3 presenting cells[J]. Microbiologyopen, 2013 ,2(4):610-617.

[6]INOUE R1, TSUKAHARA T, MATSUKAWA N, et al. Rapid induction of an immune response in rat Peyer's patch after oral administration ofEnterococcusfaecalisstrain EC-12[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2013,77(4):863-866.

[7]YOSHIKAWA T1, INOUE R, YOSHIDA Y, et al. Diverse immune responses to orally administered heat-killed cell preparation ofEnterococcusfaecalisstrain EC-12 in murine immune tissues[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2009,73(6):1 439-1 442.

[8]CETINKAYA Y, FALK P, MAYHALL C G. Vancomycin-Resistant Enterococci[J]. Clinical Microbiology Reviews, 2000, 13(4):686.

[9]OSTROWSKY B E, CLARK N C, THAUVIN-ELIOPOULOS C, et al. A Cluster of VanD vancomycin-resistantEnterococcusfaecium: molecular characterization and clinical epidemiology[J]. Journal of Infectious Diseases, 1999, 180(4):1 177-1 185.

[10]FINES M, PERICHON B P, SAHM D, et al. VanE, a new type of acquired glycopeptide resistance inEnterococcusfaecalisBM4405[J]. Antimicrobial Agents & Chemotherapy, 1999, 43(9):2 161.

[11]BOYD D A, DU T R, KAPLEN B, et al. VanG-type vancomycin-resistantEnterococcusfaecalisstrains isolated in Canada[J]. Antimicrobial Agents & Chemotherapy, 2006, 50(6):2 217.

[12]王泓, 贾文祥. 耐万古霉素肠球菌的实验室检测及防治进展[J]. 国际检验医学杂志, 2004, 25(2):128-130.

[13]PATEL J B. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing: twenty-fourth informational supplement[M]. Wayne: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2010.

[14]KARIYAMA R, MITSUHATA R, CHOW J W, et al. Simple and reliable multiplex PCR assay for surveillance isolates of vancomycin-resistant enterococci[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2000, 38(8):3 092-3 095.

[15]ELSAYED S, HAMILTON N, BOYD D, et al. Improved primer design for multiplex PCR analysis of, vancomycin-resistantEnterococcusspp.[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2001, 39(6):2 367.

[16]DEPARDIEU F, PERICHON B, COURVALIN P. Detection of the van alphabet and identification ofEnterococciandStaphylococciat the species level by multiplex PCR[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2004, 42(12):5 857.

[17]NASER S M, THOMPSON F L, HOSTE B, et al. Application of multilocus sequence analysis (MLSA) for rapid identification ofEnterococcusspecies based onrpoAandpheSgenes[J]. Microbiology, 2005, 151(7):2 141-2 150.

[18]NOGUCHI N, NAKAMINAMI H, NAKASE K, et al. Characterization ofEnterococcusstrains contained in probiotic products[J]. Biological and Pharmaceutical Bulletin,2011,34(9):1 469-1 473.

[19]RANGAN K J, PEDICORD V A, WANG Y C, et al. A secreted bacterial peptidoglycan hydrolase enhances tolerance to enteric pathogens [J]. Science, 2016, 6 306(353):1 434-1 437.