壳聚糖季铵盐和皂土在黑莓果酒澄清中的应用

黄自苏 周剑忠 李亚辉

摘要：采用L9（34）正交试验研究壳聚糖季铵盐（HACC）用量、皂土用量和澄清作用时间对黑莓果酒澄清效果和色度的影响，以果酒澄清度和色度为考核指标确定复合澄清剂澄清处理条件，并通过测定复合澄清剂澄清处理前后黑莓果酒中主要成分含量的变化和热稳定性变化，研究复合澄清剂对黑莓果酒的澄清作用。结果表明，HACC用量 0.3 g/L、皂土用量0.1 g/L、作用时间3 d为最佳处理条件。在此条件下，复合澄清剂处理后，果酒中总糖含量、滴定酸含量、乙醇度、有效酸度等变化不显著，总酚、花色苷和可溶性固形物含量变化显著（P<0.05）。澄清处理之后，热稳定性有较大提高。说明复合澄清剂是一种良好有效的黑莓果酒澄清剂。

关键词：黑莓果酒;壳聚糖季铵盐（HACC）;皂土;澄清度;热稳定性;色度

中图分类号： TS262.7  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）17-0210-03

羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖，俗称壳聚糖季铵盐（chitosan quaternary ammonium salt，HACC），是从海洋生物中提取的壳聚糖高级衍生物，一种强阳离子型高分子絮凝剂，无毒无害，其澄清机制是通过电中和与黏结架桥双重作用，使溶液中的胶体等杂质絮凝沉降，一方面HACC利用自身所带的大量正电荷与悬浮微粒及胶体所带的负电荷相互作用，降低悬浮微粒及胶体表面电荷，使其絮凝脱稳;另一方面借助于高分子链的黏结架桥作用而产生絮凝。皂土（bentonite）也叫斑脱土，是火山灰分解成的一种黏土，在果酒的pH值条件下，带有阴离子，具有较好地去除果酒中带有阳离子蛋白的能力[1-4]，是国内外果酒酿造中常用的澄清剂[5-7]。

黑莓（Rubus alleghniensis）含有较高的酚类物质和花色苷，具有优良的抗氧化、抗癌等功能特性[8-9]，同时也富含锌、硒等多种矿物质，氨基酸种类也很齐全，被誉为第3代“黄金水果”。由于黑莓为高酸型水果，口感不佳，但是有较强的加工属性，黑莓汁、黑莓酒、黑莓酱是主要的加工产品[10-12]。

对于商品果酒来说，澄清度是决定品质的一个重要指标，澄清透明、颜色清亮的果酒商品容易吸引消费者的眼球。虽然研究表明浑浊或带有沉淀的果酒对人体健康没有影响，但影响消费者的购买欲，进而影响销售市场。因此，果酒必须保持较高的澄清度和稳定性。本研究为解决发酵型黑莓果酒澄清的问题，借鑒前人的研究结果[13-14]，利用HACC和皂土作为复合澄清剂对黑莓果酒的澄清方法进行研究，旨在为黑莓酒的澄清方法提供技术支持和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料、试剂与仪器

黑莓果酒由江苏省农业科学院农产品加工研究所食品工程研究室在2017年1月采用黑莓果汁发酵酿造而成。黑莓由南京新得力食品有限公司提供，品种为赫尔。发酵菌种为酿酒酵母FM-S-115，由江苏省农业科学院农产品加工研究所保存。澄清剂皂土和HACC购于南通绿神生物工程有限公司。

UV-1600 PC型紫外可见分光光度计，购自上海美谱达仪器有限公司;SK15台式冷冻高速离心机，购自德国Sigma公司;LC-210.2精密电子天平，购自德国赛多利斯公司;WGZ-800浊度计，购上海昕瑞仪器仪表有限公司;WSC-S测色色差计，购自上海精科仪器有限公司;HI84532测定仪，购自意大利HANNA;数显恒温磁力搅拌器，购自江苏省金坛市中正仪器制造有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 黑莓果酒酿造 按照以下工艺流程进行黑莓果酒酿造：

黑莓果→清洗→打浆→酶解→调配→发酵→过滤除渣。

1.2.2 澄清剂的配制 5%皂土悬浮液的配制：称取5 g皂土，加入100 mL蒸馏水在50 ℃水浴中软化，浸泡24 h，搅拌成均匀的浆体。

1% HACC悬浮液的配制：称取1 g HACC，加入100 mL蒸馏水中，搅拌溶解成均匀的液体。

1.2.3 正交试验 以HACC和皂土为复合澄清剂处理黑莓果酒，考察复合澄清剂中HACC和皂土的合适用量和二者之间适宜的配比，同时考察澄清时间对澄清效果的影响。以HACC、皂土用量和澄清作用时间作为正交试验中的3个因素，以处理后果酒的浊度值和色度为响应值，选用L9（34）正交设计表进行试验，以确定HACC和皂土复合澄清剂处理黑莓果酒的最优化条件，具体设计见表1。

1.2.4 浊度值测量 以蒸馏水调零，用标准溶液校对仪器，然后将澄清处理好的果酒倒入试样瓶中，测其浊度值，具体操作步骤见仪器使用说明书。

1.2.5 色度的测量 将澄清处理好的果酒倒入比色皿中，以蒸馏水为参比，于420、520、620 nm处测其吸光度，以三者吸光度之和表示色度[15]。

1.2.6 热稳定性测定 将澄清处理好的果酒取5 mL置于试管中，置于70 ℃水浴中处理6 h后，取出放置在4 ℃下16 h，然后在室温下测定其在540 nm处的吸光度。以样品热处理后与热处理前在540 nm处的吸光度差值表示稳定性[16]。

1.2.7 花色苷含量的测定-pH示差法[17] 取2个10 mL棕色容量瓶，加入1 mL蒸馏水，分别加入9 mL pH值1.0缓冲液（0.2 mol/L KCl与0.2 mol/L HCl以体积比为25 ∶ 67进行配制）和pH值4.5缓冲液（1 mol/L NaAc、1 mol/L HCl与H2O以体积比为100 ∶ 60 ∶ 90进行配制），摇匀，放置2 h，分别测定510、700 nm处的吸光度，作为对照组。测定样品时，将黑莓果酒离心，取1 mL果酒上清液，用蒸馏水稀释3倍后，按照上述步骤进行测定。花色苷含量按照以下公式进行计算：

花色苷含量（mg/mL）=D×MW×F/（ε×l）。

式中：D=（D510 nm-D700 nm）pH值1.0-（D510nm-D700 nm）pH值4.5;MW为矢车菊素-3-葡萄糖苷分子量，取449.2;F为稀释倍数;ε为矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数，取 26 900;l为比色皿光程，1 cm。

1.2.8 总酚含量的测定（以没食子酸计）-福林酚法（Folin-ciocalteu）[18] 配制质量浓度为0、5、10、15、25、50、100 mg/L的没食子酸溶液，分别取1 mL于10 mL棕色容量瓶中，加入1.5 mL去离子水和0.5 mL Folin-ciocalteu试剂，摇匀后在1 min内加入20%（质量浓度）Na2CO3溶液 1.5 mL，摇匀后定容至10 mL，20～30 ℃暗处放置2 h，在波长 765 nm 处测定吸光度，以没食子酸浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

果酒中总酚含量测定：取1 mL果酒，用蒸馏水稀释100倍后按照上述步骤进行测定，根据标准曲线计算果酒中的总酚含量。

1.2.9 总酸度的测定 采用HI84532总酸测定仪进行测定，具体操作步骤参照仪器使用说明书。

1.2.10 可溶性固形物的测定 采用阿贝折光仪测定，具体操作步骤见仪器说明书。

1.2.11 乙醇度测定 采用蒸馏乙醇比重法[19]。

1.4 数据统计与分析

利用Excel 2003统计所有数据，利用SPSS 11.5软件进行方差分析确定因素显著性。

2 结果与分析

2.1 复合处理对黑莓果酒澄清度和色度的影响

为了获得澄清度和稳定性较好的黑莓果酒，本研究选择HACC和皂土作为黑莓果酒的复合澄清剂，分析HACC用量、皂土用量和澄清作用时间3个变量因素对黑莓果酒澄清度和色泽的影响。以澄清度和色度作为复合澄清剂处理黑莓果酒效果的考察指标，按照表1进行试验，试验结果及方差分析见表2。从表2中可以看出，3个因素对黑莓果酒澄清度的影响大小依次为HACC用量、皂土用量和澄清作用时间，最佳组合为A3B3C2。对黑莓果酒色度的影响大小依次为HACC用量、皂土用量和澄清作用时间，最佳组合为A1B1C1。复合澄清处理中各因素对澄清度的方差分析结果见表3，HACC用量对黑莓果酒的澄清度影响显著（P<0.05），皂土用量和澄清作用时间对澄清度的影响不显著。复合澄清处理中各因素对黑莓果酒色度的方差分析结果见表4，HACC用量对黑莓果酒的色度影响显著（P<0.05），皂土用量和澄清作用时间对色度的影响不显著。综合表2、表3和表4的结果可以看出，HACC用量对澄清度、色度影响显著，但在果酒的澄清处理中，除了考虑澄清效果，还要尽量保持果酒原有的色泽，综合考虑澄清度和色度的处理效率，HACC用量选取A2;本复合澄清处理过程中，皂土用量对澄清度和色度的影响不显著，取B1;澄清作用时间对澄清度和色度的影响都不显著，同时考虑生产效率，取C1。综合分析，本试验较优条件为A2B1C1，即使用HACC用量0.3 g/L，皂土用量0.1 g/L，澄清作用时间为3 d。

2.2 验证试验

按照所得最优试验条件进行黑莓果酒澄清处理，重复3次，进行验证，澄清处理后黑莓果酒的浊度值为3.64，色度值为1.79。

2.3 澄清剂对黑莓果酒中主要成分的影响

黑莓果酒经复合澄清剂澄清处理后（HACC用量 0.3 g/L，皂土用量0.1 g/L，处理时间为3 d）， 果酒中的主要成分变化结果见表5。复合澄清剂处理前后，果酒中的总糖含量、乙醇度、滴定酸含量和有效酸度变化不显著。但是澄清处理对果酒中的总酚含量、花色苷含量和可溶性固形物含量的影响显著（P<0.05）。酚类物质是果酒中一类重要组分，其对果酒的感观特性包括颜色、风味和口感等，具有重要贡献，同时也是引起果酒沉淀的一类重要的非生物因素[20-22]。聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）能够吸附酚类物质，在酿酒工业上被作为澄清剂，能够降低果酒的浑浊，这表明酚类化合物在果酒沉淀中扮演重要角色[23]。以上结果表明，复合澄清剂能够很好地去除果酒中导致沉底的酚类物质，进而达到果酒澄清的目的。

2.4 澄清剂处理前后的热稳定性

将经过复合澄清剂处理的黑莓果酒放置不同的时间，测定其热稳定性，具体结果见表6。经复合澄清剂处理后的黑莓果酒的热稳定性要明显优于未经处理的，没有经过澄清处理的黑莓果酒在热处理（70 ℃）后，ΔD540 nm随着时间的延长而增大。当储存时间为12个月时，澄清處理后果酒的ΔD540 nm为0.002。Marangon等的研究表明，果酒经过热处理之后，ΔD540 nm值小于0.02，则认为果酒的澄清度是稳定的，不会产生浑浊或沉淀[24]。由此可见，黑莓果酒经过HACC和皂土复合澄清处理后，能保持良好的澄清稳定性。

3 结论

复合澄清剂处理黑莓果酒的最佳处理条件为HACC用量0.3 g/L，皂土用量0.1 g/L，处理时间为3 d。经复合澄清处理后，果酒中的总糖含量、乙醇度、滴定酸含量和有效酸度变化不显著，但是澄清处理对果酒中的总酚含量、花色苷含量和可溶性固形物含量的影响显著（P<0.05）。HACC和皂土作为复合澄清剂处理黑莓果酒，能显著提高果酒的热稳定性，从而提高了果酒品质的稳定性。

参考文献：

[1]Lambri M，Dordoni R，Silva A，et al. Effect of bentonite fining on odor-active compounds in two different white wine styles[J]. American Journal of Enology and Viticulture，2010，61（2）：225-233.