未分化甲状腺癌相关基因的生物信息学分析

赵静，张家明，杜雅莹，李兴睿

(华中科技大学同济医学院附属同济医院，武汉430000)

甲状腺癌是最常见的内分泌恶性肿瘤，约占所有内分泌相关恶性肿瘤的95%[1]，按其恶性程度可分为分化良好的甲状腺癌(WDTC)、低分化甲状腺癌(PDTC)和未分化甲状腺癌(ATC)。多数甲状腺癌发展缓慢，患者整体预后较好。ATC是恶性程度最高的甲状腺癌，发病率约占甲状腺癌总发病率的2%[2]，其特点为发病突然、进展迅速和预后极差，确诊时多已出现周围组织器官侵犯，15%～50%的患者伴肺、骨、脑、肝等远处转移[3]，患者中位生存期仅3～6个月，5年生存率低于10%[4]。由于ATC失分化而无摄碘能力，其生长不受促甲状腺激素的影响，因而放射性131I治疗和促甲状腺激素抑制治疗均无明显效果[5]，此外，大部分ATC难以完全切除，且对放化疗敏感性较低。因此，分子靶向治疗有望成为ATC治疗的发展方向之一。生物信息学是一门结合分子生物学与计算机信息技术的新型交叉学科，基因表达谱芯片是一种高效率、大规模获取基因表达数据的技术。应用生物信息学的方法分析基因表达谱芯片，可实现在全基因组水平上进行大规模、高通量、高灵敏度、高精确度的基因序列测定及功能研究。本研究通过对美国国家生物信息中心(NCBI)GEO数据库中的ATC基因表达谱芯片进行挖掘，筛选得到ATC与正常甲状腺组织的差异表达基因(DEGs)，对差异基因进行功能富集、蛋白-蛋白相互作用网络构建等生物信息学分析，初步预测靶向作用于差异基因的关键转录因子和microRNA，进一步在ATC细胞系与正常甲状腺组织细胞系表达谱芯片中验证关键DEGs和转录因子的表达，初步从分子水平探究ATC发病机制、寻找潜在的ATC治疗靶点。

1　 材料与方法

1.1芯片来源 基因表达谱芯片来源于美国国家生物信息中心(NCBI)的GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，3组芯片均为全基因组RNA表达谱芯片，序列号分别为GSE65144、GSE53072和GSE9115。GSE65144由von Roemeling CA等提交，研究包括12例人类ATC组织样本及与之配对或非配对的13例正常甲状腺组织样本。GSE53072由Pita等提交，研究包括5例人类ATC组织样本(3例样本来自术中冰冻切片，3例样本来自细针穿刺组织)，3例配对的正常甲状腺冰冻切片样本和1例人类正常甲状腺组织RNA杂交池样本。GSE9115由Salvatore G等提交，研究包括5例人类ATC组织样本和4例正常甲状腺组织样本。

1.2数据处理及差异基因筛选从GEO数据库中下载原始芯片表达谱数据，使用R软件(version 3.3.3)及R Bioconductor软件的affty、limma、ggplot2、VennDiagram等软件包，对表达谱数据进行质量控制、背景校正、标准化和数据汇总，使用经验贝叶斯分析方法筛选出ATC和正常甲状腺组织的差异表达基因。选取差异倍数(FC)和校正后P作为筛选指标，以|log FC|>1且adjustP<0.05作为筛选标准，分别选取3组芯片数据中表达差异显著的基因合并取交集后，得到267个差异基因作为研究对象。

1.3差异基因富集分析及蛋白相互作用网络分析将267个差异基因导入在线富集分析数据库DAVID(https://david.ncifcrf.gov)，分别从生物学过程、分子功能、细胞组分三个方面进行在线功能富集GO分析，应用在线数据库KEGG(http://www.genome.jp/kegg/pathway.html )对差异基因进行生物学信号通路富集分析。通过STRING在线分析平台(https://string-db.org )构建蛋白-蛋白相互作用网络(PPI)，分析差异基因编码的蛋白质之间的相互作用关系，应用Cytoscape软件(version 3.5.0)及其插件CytoHubba和MCODE对PPI网络进行可视化和分析，计算单个蛋白质节点与其他节点间的相互作用关系强度，评估蛋白质间相互作用关系的密切程度，并创建PPI子网络。

1.4转录因子-差异基因调节网络分析和microRNA-mRNA调节网络分析使用数据库WebGstalt(http://www.webgestalt.org/option.php )预测microRNA与差异基因转录后mRNA的靶向作用关系，构建microRNA-mRNA靶向作用网络，预测ATC中发挥关键作用的microRNA。

1.5ATC细胞系中潜在靶点基因表达的验证从GEO数据库中下载原始芯片表达谱数据集GSE85457，该芯片由Weinberger 等提交，样本包括四个ATC细胞系和三个正常甲状腺细胞系。通过R软件(version 3.3.3)及R Bioconductor软件的affty、limma软件包和Affymetrix Expression Console Software(verversion1.4)，使用经验贝叶斯分析方法计算ATC细胞系和正常甲状腺细胞系的基因表达水平，得到基因表达差异热图，并与ATC组织中预测得到的重要DEGs和关键转录因子的基因表达水平进行对比验证，进一步证实潜在靶点基因在ATC中的表达水平，提高预测的可信度。

2　 结果

2.1筛选的差异基因3组芯片差异基因分别筛选取交并集后共有273个表达差异基因，其中共同表达上调基因108个，共同表达下调基因159个，共267个表达差异基因。

2.2富集分析和蛋白相互作用网络分析 DAVID数据库GO富集分析结果显示，差异基因主要参与细胞分裂、细胞增殖、调节细胞周期检查点、有丝分裂中的核分裂和胞质分裂、DNA复制、细胞缺氧反应、细胞间黏附作用、上皮-间质转化等生物学过程，差异基因主要与细胞质、外泌体、细胞膜、细胞中心体、着丝粒等细胞组分有关，其主要分子功能为ATP结合、蛋白质同源二聚化、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性等。KEGG信号通路分析显示，差异基因富集得到的信号通路主要有细胞周期、吞噬、精氨酸和脯氨酸代谢和HIF-1信号通路。通过对差异基因编码的蛋白质进行STRING在线分析、Cytoscape软件可视化处理，得到包含179个蛋白质节点和561条互作线的蛋白-蛋白互作(PPI)网络。在PPI网络中，有一部分蛋白质节点与其他节点有较多连接，称之为中心节点(HUB)。使用Cytoscape插件CytoHubba计算蛋白节点间相互作用关系，得到相互作用关系度最高的10个中心节点， BUB1、CCNB2、AURKA、CCNA2、BUB1B、CDC6、CDH1、KIF23、CENPA和KIF2C。

2.3转录因子调节网络分析和microRNA-mRNA调节网络分析通过在线数据库WebGstalt预测靶向作用于差异基因的转录因子和作用于差异基因mRNA的microRNA，Cytoscape可视化处理后得到转录因子-基因调节网络(图1)和microRNA-mRNA调节网络(图1)，其中转录因子E2F、NFY、HFH4和E2F1DP2与差异基因相互作用关系密切，可能是ATC中调节差异基因表达的关键转录因子。microRNA15a、microRNA15b、microRNA16、microRNA195、microRNA424和microRNA497等与18个差异基因mRNA存在相互作用关系，可能通过调节基因转录后的mRNA水平，在ATC发生发展中发挥重要作用。

2.4ATC细胞系中潜在靶点基因的表达验证 ATC组织中预测得到的潜在靶点基因，包括重要的DEGs(BUB1、CCNB2、AURKA、CCNA2、BUB1B、CDC6、CDH1、KIF23、CENPA、KIF2C)和关键转录因子E2F、NFY。在ATC细胞系中，重要的DEGs表达水平与其在ATC组织中的表达水平一致，均呈表达上调，转录因子E2F1、E2F2、E2F7、E2F6在ATC细胞系中表达均上调，转录因子NFY在ATC细胞系中的表达无统计学差异。进一步验证了ATC与正常甲状腺组织中预测所得潜在靶点基因的表达。

注：A:转录因子调节网络;B:microRNA调节网络。

图1转录因子-基因调节网络

3　 讨论

本研究通过生物信息学的方法筛选得到267个ATC与正常甲状腺组织的差异基因，其中表达上调基因108个，表达下调基因159个。基因富集分析发现，差异基因主要参与细胞分裂增殖、细胞间黏附作用和上皮-间质转化等生物学过程。细胞异常分裂和增殖失控是肿瘤发生发展过程中的关键环节，而细胞间黏附降低和上皮-间质转化则在肿瘤细胞的迁移和侵袭过程中起到重要作用。上皮-间质转化是肿瘤细胞以鹅卵石样上皮表型向狭长状成纤维细胞样转换并获得间质表型过程，不仅参与肿瘤的迁移和侵袭，且与细胞抗衰老、抗凋亡和肿瘤细胞耐药、耐放疗等密切相关[6]。KEGG富集分析表明，差异基因主要涉及2条肿瘤相关通路：细胞周期相关通路和HIF-1信号通路。由于肿瘤细胞恶性增殖速率过快，局部血管网无法为瘤体提供充足氧气从而形成了局部缺氧的微环境[7]。HIF-1是转录调节因子，通过调控一系列与缺氧有关的基因转录，使癌细胞克服缺氧环境。另外，HIF-1促进选择性的线粒体自噬，诱导多能性肿瘤干细胞生成，促进上皮-间质转化，降低E-cadherin表达等，从而促进肿瘤的生长和进展[8]。

通过对差异基因编码的蛋白质之间的相互作用进行分析，构建出以BUB1、CCNB2、AURKA、CCNA2、BUB1B、CDC6、CDH1、KIF23、CENPA、KIF2C等为中心节点构成的蛋白-蛋白互作网络。BUB1是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，调控细胞周期和染色体内聚，在有丝分裂中起到核心作用。BUB1还具有调控TGF-β通路的重要作用，正常情况下TGF-β是肿瘤抑制因子，BUB1与TGF-β受体结合导致TGF-β转变为肿瘤促进因子，刺激正常细胞异常增殖进而恶变，促进肿瘤细胞的增殖和转移[9]。CCNB2是细胞周期蛋白家族的一员，在细胞分裂的G2/M期进展中起关键作用，研究发现CCNB2在膀胱癌[10]、非小细胞肺癌[11]等恶性肿瘤中均为高表达。PPI第1个子网络中，表达上调的蛋白PBK、KIFC1、TTK、NEK2、KIF2C、CHEK1、AURKA、CDC7、BUB1均属于细胞分裂蛋白激酶家族，在细胞增殖和细胞周期调控中有重要作用，蛋白激酶过度激活可引起细胞异常增殖分化。第2个子网络中，表达上调的蛋白NUSAP1、ZWILCH、CENPI、CENPF、CENPA、TPX2、ZWINT、MCM6均与细胞有丝分裂过程中染色体、纺锤体等细胞器相关，表明与正常细胞相比，ATC存在异常旺盛的细胞分裂和增殖。

转录因子可与基因特定序列靶向结合，调节目的基因的时间空间表达及表达强度。转录因子调节网络中，转录因子E2F在差异基因的转录调控中起到重要作用。转录因子E2F在调控细胞周期进程方面具有重要作用，通过调控G1/S期DNA合成所需的时相基因控制细胞周期过程。WebGstalt在线数据库是基于网络的整合数据挖掘系统，可预测靶向结合并调节差异基因转录的转录因子，构建转录因子-mRNA靶向作用网络，预测ATC中发挥关键作用的转录因子。研究表明，E2F与肿瘤发生发展、血管新生、转移等有关，与乳腺癌预后密切相关[12]，因此ATC发病可能与E2F转录调节活性失调有关。microRNA为一类转录后水平的调控因子，通过作用于基因转录出的mRNA来调节目的基因表达。microRNA-mRNA调节网络中，microRNA-15家族参与调节凋亡、细胞周期调控、代谢等，在肿瘤发生发展中起重要作用[13]。

综上所述，通过对ATC芯片数据的生物信息学分析，初步预测基因BUB1、CCNB2、AURKA、CCNA2、BUB1B、CDC6、CDH1、KIF23、CENPA、KIF2C及转录因子E2F和microRNA-15家族有望成为ATC分子靶向治疗潜在靶点。

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