响应面法优化竹叶黄酮的提取工艺

曹　婧　侯春久　黄志飘

竹叶为禾本科植物竹叶(Lophatherum gracile Brongn.)的干燥茎叶，性寒，味甘、淡，归心、胃、小肠经，有清热除烦、利尿的功效，用于热病烦渴，小便赤涩淋痛，口舌生疮等症[1-3]。竹叶主要含有黄酮、三萜类、多糖、酚性成分、氨基酸、有机酸及多种微量元素，其中黄酮为主要有效成分[4]。本实验以竹叶总黄酮为对象，采用乙醇水浴浸提的方式，通过响应面分析法对工艺进行优化，对拟合数学模型进行描述，为竹叶总黄酮的进一步开发和利用提供科学依据[5-6]。

1　实验器材

1.1主要仪器 JY/JP电子天平（上海上天精密仪器有限公司）；722型紫外/可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；实验室小型粉碎机，干燥箱（金坛市富华电器有限公司）；旋转蒸发仪（予华仪器有限公司）；恒温水浴锅（江苏正基仪器有限公司）。

1.2原材料 新鲜竹叶（采自江苏宜兴基地，经烘箱60℃干燥后粉碎未过筛）。

1.3主要试剂 芦丁标准品（北京谱析科技有限公司）；硝酸铝；乙醇等试剂为国产分析纯，实验室用水为一次蒸馏水。

2　方法

2.1干燥粉碎 将竹叶洗净，蒸馏水浸泡24 h，烘箱烘至恒重。将干燥淡竹叶剪碎后，研磨，不过筛，备用。2.2绘制标准曲线 以芦丁标准品为对照，精密称取0.01 g芦丁对照品，用75%乙醇溶解，定容在100 mL的容量瓶中，配制成0.1 mg/mL的母液，再分别精密量取2 mL、4 mL、8 mL、12 mL、16 mL、20 mL于100 mL容量瓶中，加2 mL的10%硝酸铝，充分振荡5 min，再加75%乙醇补充至刻度，并以75%乙醇为参比液，于510 nm处测定吸光度，绘制芦丁标准曲线。

2.3竹叶黄酮的提取及测定方法 称取规定量的竹叶样品，加入规定体积和浓度的乙醇，在规定温度下加热回流提取规定的时间，过滤，收集滤液，滤渣用少量同浓度的乙醇洗涤3次，合并上述滤液，然后在旋转蒸发仪上蒸干，加75%乙醇溶解并转移至50 mL的容量瓶中定容，充分摇匀备用。分别从各组单因素实验得到的样品溶液中移取1 mL，加2 mL的10%硝酸铝，再加75%乙醇补充至25 mL，并以75%乙醇为参比液，于510 nm处测定吸光度。

3　结果与分析

3.1标准曲线 根据不同芦丁浓度对应的吸光度，计算得到曲线方程为：A=17.36C-0.0059，相关系数R2为0.9998。

3.2单因素试验结果

3.2.1料液比对提取率的影响 按照实验方法2.3项，称取3 g左右的竹叶粉末（未过筛），在60℃下用80%的乙醇水浴浸提4 h，改变料液比。实验结果见图1。随着固液比的增加，总黄酮提取率呈现由低到高，并趋于稳定的趋势。一方面溶剂的增加可以增大物料与溶剂的接触面，有利于扩散速度的提高[7]；另一方面，当固液比达到1∶20时，黄酮溶出已趋于稳定，所以继续增大固液比，提取率变化不大。因此固液比选择1∶20为宜。

图1　固液比对提取率的影响

3.2.2提取时间对提取率的影响 按照实验方法2.3项，称取3 g左右的竹叶粉末（未过筛），固定料液比1∶20，在60℃下用80%的乙醇水浴浸提，改变浸提时间。实验结果见图2。竹叶黄酮的提取率先逐渐增大，当提取时间为4 h时达到最高，然后再延长提取时间提取率又开始下降，这说明浸提时间过短，黄酮类物质还未充分溶出，而时间过长，一些热敏性组分被破坏或部分溶剂挥发导致乙醇浓度降低而使黄酮类化合物提取率降低[7]。

图2　提取时间对提取率的影响

3.2.3提取温度对提取率的影响 按照实验方法2.3项，称取3 g左右的竹叶粉末（未过筛），固定料液比1∶20，在不同温度下用80%的乙醇水浴浸提4 h，实验结果见图3。随着温度的升高，提取率随之增加，并呈缓缓上升趋势，当温度达到70℃时提取率最大，温度超过70℃后提取率略有下降，这是由于随着温度的升高，黄酮类物质的扩散速率加快，溶解度也增大，提取率提高，但温度过高，会造成黄酮类物质容易被破坏而使提取率下降，并且也会使后续操作更为困难。因此提取时温度选择70℃为宜。

图3　提取温度对提取率的影响

3.2.4乙醇浓度对提取率的影响 按照实验方法2.3项，称取3 g左右的竹叶粉末（未过筛），固定料液比1∶20，在60℃下用乙醇水浴浸提4 h，改变乙醇溶液的浓度，实验结果见图4。随着乙醇浓度的升高，提取率先变化不明显，然后在70%～80%范围内呈明显上升的趋势，当乙醇浓度达到80%时，提取率最高，黄酮类物质的溶解度达到最大，之后提取率下降，这可能是由于部分黄酮是水溶性的，随着乙醇浓度的增大，水的含量变少，这样水溶性的部分不能充分溶解出来造成的。

图4　乙醇浓度对提取率的影响

3.3响应面法优化提取竹叶黄酮 选取影响提取过程较大的3个因素：提取时间、提取温度、乙醇浓度为自变量，应用Design-Expert8.0.6Box-Behnken设计[8-9]优化提取竹叶黄酮的工艺条件。称取3 g左右的竹叶粉末（未过筛），固液比1∶20，实验因素及其水平设计见表1。

表1　自变量及其水平

实验按随机化的原则进行，以减少随机误差。实验安排及结果见表2。

表2　实验安排及结果

3.3.1模型评价 将所得实验数据进行多元回归拟合，得到竹叶黄酮提取率Y与乙醇提取各因素变量的二次回归方程模型为：

Y=0.67+0.017X1+0.008125X2+0.034X3+0.024X1X2-0.055X2X3-0.078 X12-0.07 X22-0.05 X32

对乙醇提取竹叶黄酮的数学模型进行分析，来检查该方程的有效性。此模型的相关性系数R2为0.9834，线性关系显著。F值越大，P值越小意味着该项越显著。从表3可以看出，回归的模型极其显著（＜0.0001），同时失拟项不显著（P=0.2050），一次项中X1、X3的回归系数显著，说明提取时间和乙醇浓度对黄酮提取率有显著影响。交互项X1X2和X2X3的偏回归系数极显著，说明提取时间和提取温度、提取温度和乙醇浓度的交互项对提取率有显著影响。说明该方程拟合较好。在所选取的三因素水平范围内，按照对提取率的影响排序，乙醇浓度对提取率影响最大，提取时间次之，提取温度影响最小。

表3　回归系数的显著性分析

3.3.2响应面分析 3-D曲面是回归方程的直观表达形式。考察拟合响应曲面的形状，分析提取时间、提取温度和乙醇浓度对黄酮提取率的影响。结果见图5。由图5可以看出，两个响应曲面均为开口向下的凸形曲面，说明响应值存在极高值。在3个因素的交互作用中，提取温度的提高，提取时间的增加，都有助于黄酮的充分溶出，而乙醇浓度的增加增大了黄酮的浓度梯度，从而提高了黄酮的溶出速度和得率。

3.3.3最优条件及验证 利用Design-Expert 8.0.6软件中Box-Behnken设计对回归模型进行求解，得到最佳工艺条件。我们将实验放大10倍，称取30 g左右的竹叶粉末（未过筛），固液比1∶20，在70℃下用80%乙醇水浴浸提4 h，按照实验方法2.3项求出黄酮提取率，平行实验三次。实验结果为0.6578%，与预测值比较吻合，表明模型是可靠的。

图5　响应面图

4　结论

本研究是在单因素实验的基础上，采用响应面法优化乙醇提取竹叶黄酮的工艺参数，再建立了回归方程模型，该模型回归极显著，且失拟项不显著，说明该方程对实验拟合较好。根据优化提取条件进行验证实验，在80%乙醇，提取温度70℃，提取时间4 h，固液比1∶20的条件下，竹叶黄酮提取率为0.6578%。得到的黄酮具有较高的医用和食用价值，为竹叶黄酮的进一步研究提供了一定的参考依据。

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