不同结构羊舍空气可培养真菌ERIC-PCR指纹图谱分析

乔婷婷，于　欢，段晋伟，刘家祺，白燕雨，郭　耀，高晓莎，张艳冰，霍乃蕊，刘兴国，古少鹏

（1.山西农业大学动物科技学院，山西太谷　030801；2.中国动物疫病预防控制中心，北京　100125）

动物养殖过程中产生的大量真菌气溶胶及其代谢产物可引发多种动物疾病，给养殖业带来巨大威胁[1]，也极易引起经常暴露于真菌气溶胶中的兽医和养殖人员的真菌感染[2]。空气中大部分真菌孢子可以通过呼吸道或伤口进入人或动物体内，引起各种疾病[3-4]。因此，全面了解圈舍空气真菌菌群结构，对于维护畜舍环境卫生和控制疾病发生具有重要意义。传统的真菌研究方法，如显微镜观察和分离培养等，不能准确反映菌群组成情况[5]。研究表明，ERIC-PCR可以用于分析人工培养的混合菌，甚至是天然复杂微生物群落的组成特征[6-8]，Pan等[9]证实ERIC-PCR可以比较不同群落结构特征的差异以及同一群落在一段时间内菌群的变化过程。目前，该技术广泛应用于菌种分类，以及肠道菌群、废水处理和发酵过程中微生物菌群指纹图谱建立[10-14]，并用于确定畜舍气载微生物的传播途径及畜舍环境真菌气溶胶的组成[15-17]。本研究利用ERIC-PCR技术，分析比较2种结构羊舍气载真菌菌群结构的整体差异，旨在为羊舍的选择及环境控制提供依据。

1　材料与方法

1.1　圈舍

羊舍选自山西省晋城市泽州县规模化肉羊养殖场。结构分别为双列式地面结构和双列式高床结构。羊舍两侧墙体设窗，屋顶装有无动力风机。高床平养羊舍设漏缝地板，饲养密度为0.73～1.51 m2/只；地面平养羊舍为水泥地面，饲养密度为0.56～1.29 m2/只。每种结构羊舍分别选择3栋羊舍作为研究对象。

1.2　样本采集及处理

空气样本采集使用AGI-30采样器（辽宁康洁），采样基质为超纯水（15 mL），采样流量为8 L/min，时间为30 min；分别于四季采集样本，每个季节连续采集3次，每次3个重复；采样高度与羊呼吸高度一致，采样同时测定温度、相对湿度和风速等环境参数（表1）；采样结束后低温保存。

1.3　DNA提取

将重复采集的液体样本混合后，在马铃薯葡萄糖肉汤（Solarbio，P9240）中富集培养，使用真菌基因组DNA提取试剂盒（Solarbio，D2300）提取DNA，用NanoDrop ND-1000（美国NanoDrop）测定DNA浓度，OD260与OD280比值在1.8～2.0之间的可以用作PCR扩增模板。

1.4　ERIC-PCR扩增

表1　采样点环境参数

ERIC引物由北京擎科生物公司合成，序列为：5´-ATGTAAGCTCCTGGGGA TTCAC-3´和5´-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3´。

扩增反应体系为20.0 μL，含10×PCR Buffer（Mg2+plus）2.0 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）1.6 μL，rTaq（5 U/μL）0.2 μL，引物（10.0 mol/L）各1.0 μL，模板DNA（100.0 ng/μL）0.2 μL，ddH2O 14.0 μL。反应条件为：94 ℃预变性5 min，90 ℃变性30 s，52.5 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min（32个循环），72 ℃延伸10 min。产物用1.8%琼脂糖凝胶电泳检测，点样量为5.0 μL，用凝胶成像系统（UVP）拍照后分析结果。

1.5　ERIC-PCR指纹图谱统计分析

对ERIC-PCR指纹图谱，利用QuantityOne 4.6.2 软件进行UPGMA（Unweighted pair group mean average）聚类分析，并计算相似性指数；采用Shannon-Wiener指数和Simpson优势度指数进行多样性分析[18]。

2　结果与分析

2.1　羊舍气载可培养真菌菌群的ERIC-PCR图谱

ERIC-PCR图谱结果显示，各样本DNA片段长度在100～2 000 bp之间不等，少量在2 000 bp以上（图1）；样本间存在一些相同谱带，可见样本间存在共有优势菌群；高床羊舍样本的扩增条带数多于地面羊舍，并以冬季差别最为明显（泳道10～12、22～24）。

图1　羊舍气载真菌菌群ERIC-PCR指纹图谱

2.2　羊舍气载可培养真菌菌群结构相似性分析

聚类树状图可见多数样本按照羊舍结构形成分枝，表明羊舍结构对空气真菌菌群结构有影响；相同羊舍同一季节样本聚集在一个分枝，说明同一季节羊舍内真菌菌群结构相对稳定（图2）。高床平养舍内空气真菌菌群在不同季节的相似度为22.6%～74.4%，地面平养羊舍相似度为9.1%～85.4%，表明同一羊舍不同季节之间真菌菌群结构变化较大（表2）。

图2　羊舍气载可培养真菌菌群聚类分析树状图

表2　羊舍气载可培养真菌菌群指纹图谱的相似度 单位：%

高床平养羊舍各季节样本相似度为春季56%～73.5%、夏季25.6%～70.5%、秋季67.7%～70.4%和冬季26.8%～53.7%；地面平养羊舍样本相似度为春季27.2%～60.7%、夏季50.6%～68.8%、秋季35.4%～73.7%和冬季24.5%～46.9%（表2）。

2.3　羊舍气载可培养真菌菌群多样性和优势度分析

Shannon-Wiener指数和Simpson指数分别表示羊舍空气可培养真菌菌群的多样性和优势度。结果显示高床平养羊舍可培养真菌菌群的多样性指数高于地面平养羊舍，但优势度指数偏低。其中高床羊舍可培养真菌菌群多样性为春季＞秋季＞夏季＞冬季，优势度为冬季＞夏季＞秋季＞春季；地面羊舍为夏季＞春季＞秋季＞冬季，优势度为冬季＞秋季＞春季＞夏季（表3）。

表3　羊舍气载可培养真菌菌群的Shannon-Wiener多样性指数和Simpson优势度指数

3　讨论与结论

ERIC-PCR技术可以通过不同样品之间条带分布变化、数量增减和亮度变化等信息，判断样品中菌群结构的变化[20-21]，并广泛应用于肠道菌群、废水处理以及发酵过程中微生物菌群结构监测。苗增民[17]借助计算机软件，对不同结构兔舍气载真菌扩增图谱分析后发现，封闭式兔舍的多样性高于半封闭式兔舍。本试验通过对羊舍可培养真菌样本的ERC-PCR图谱分析发现，泳道代表的样本根据羊舍结构形成分枝，高床羊舍的多样性高于地面羊舍，且存在一定优势菌群，表明羊舍结构对气载真菌的多样性有影响。熊云梅[22]研究发现了牛舍内气载微生物含量具有明显的季节变化。Ana等[23]也提出真菌分布具有明显的季节变化。本次检测发现同一结构羊舍在不同季节的图谱间相似性较低，也说明季节在一定程度上会影响羊舍气载真菌分布。季节变化可引起羊舍温度和相对湿度等环境参数变化，这些变化会影响真菌菌群分布。研究证明羊舍空气真菌含量与温度呈正相关，与相对湿度呈负相关[24]；Lin等[25]也提出在25～30 ℃、相对湿度60%～70%、风速＞1 m/s条件下，真菌气溶胶浓度的总菌落计数最高。综上所述，认为圈舍结构影响真菌菌群的多样性，而且真菌菌群种类的分布也受季节影响。

多样性和优势度是微生物群落的重要性质。目前对空气真菌菌群的多样性和优势度研究较少。本试验借用了生态学上Shannon-Wiener公式和Simpson公式，计算各样本图谱条带的多样性指数和优势度指数。结果显示，高床羊舍的多样性指数较高，优势度指数较低，说明高床羊舍空气环境真菌种群丰富度较高，真菌区系结构复杂，但优势菌群不明显，而地面羊舍相反，提示菌群优势度增加可能会引起菌群多样性减少。这与王燚等[26]的观点相同。冬季2种结构羊舍气载真菌菌群多样性指数最低，优势度指数最高，说明冬季羊舍空气环境真菌的多样性较少或者真菌区系结构简单，但是优势菌群明显，说明某一优势菌的增加会影响菌群的多样性。

ERIC-PCR技术虽然不能确定羊舍空气中所含真菌的具体种类，但能直观反映空气中真菌群落组成信息。若羊舍空气中某一优势菌大量存在，势必引起 DNA指纹图谱发生变化，因此可以为羊舍空气真菌的监测和环境控制提供依据。

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