猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒一步法双重荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

于新友，李天芝

（山东绿都生物科技有限公司，山东滨州　256600）

猪瘟（Classical swine fever，CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一种高度接触性、致死性猪传染病，临床上以高热稽留、皮肤和黏膜出现大量出血点和高死亡率为主要特征。世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定通报传染病之一[1]，我国将其列为一类动物疫病。近年来，我国猪CSF的流行特点发生了改变，出现了所谓的“非典型猪瘟”“温和型猪瘟”和“带毒母猪综合征”[2]，临床症状与剖检病变均不典型[3]，同时存在着与其它病原的混合感染。这对CSF的临床诊断带来了很大困难。

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一种接触性猪传染病，临床上主要表现为妊娠母猪流产，产死胎、木乃伊胎等繁殖障碍，以及各年龄段猪群，特别是仔猪的严重呼吸道症状[4]。

PRRS在临床上很难与其它病原鉴别，且常与CSF混合感染，只能通过实验室确诊。传统的CSF、PRRS诊断方法主要包括病毒分离鉴定、酶联免疫吸附试验（ELISA）、胶体金试纸条、荧光抗体试验、常规RT-PCR、环介导等温扩增技术、横向流动试纸条技术、胶体检测法等。这些方法在敏感性、特异性、时效性等方面都存在各自的不足，尤其不适于病毒感染的早期快速诊断。比如：病毒分离鉴定耗时长；血清学方法可能会出现一定的交叉反应，且敏感性低，不能用于早期检测；常规RT-PCR技术不能对病毒进行定量；环介导等温扩增技术易出现假阳性结果；横向流动试纸条技术目前还不太成熟，没有大规模推广应用；胶体金检测虽然方便，适合基层应用，但敏感性太低，有时特异性不好，容易出现假阳性结果。

荧光定量PCR技术经过20多年发展已经成熟，同时由于便携式荧光定量PCR仪的研发成功，使其检测成本大幅度降低，是当前最适用的临床检测技术。本研究根据CSFV和PRRSV基因序列，分别设计引物和探针，通过优化荧光RT-PCR检测条件，建立的适合现场检测的TaqMan一步法荧光RT-PCR检测方法，可对CSF和PRRS进行快速诊断，为这两种疾病的早期快速诊断、流行病学调查、防控和净化奠定了基础。

1　材料和方法

1.1　病毒株与病料

CSFV、PRRSV、猪细小病毒（PPV）、猪乙型脑炎病毒（JEV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV2）由本实验室保存；临床检测病料为2017年1月至2017年11月采自山东省各地猪场临床诊断为疑似CSFV和PRRSV感染的猪扁桃体、肺脏、脾脏、淋巴结等。

1.2　试剂和试剂盒

Taq DNA聚合酶、M-MLV反转录酶、RNasin、dNTPs、pMD18-T载体、DL2000 Marker、PrimeScript™ One Step RT-PCR Kit Ver.2：购自宝生物工程（大连）有限公司；AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒：购自爱思进生物技术（杭州）有限公司。

1.3　引物和探针

应用DNAStar软件，对GenBank中收录的CSFV基因组序列进行比对分析；应用生物学软件，分别设计2对引物及相应TaqMan探针。其中，一对引物及相应的探针扩增CSFV。引物序列为CSFV-F1：5´-AGTAGTTCGACGTGAGCA-3´；CSFV-R1：5´-CCCATCACATGGTGTGATTTCACC-3´；特异性探针为P 1：5´-F A MTGAGCAGGAGCCCACCTCGAGATGCT -3´。另一对引物及相应的探针扩增PRRSV。引物序列为PRRSV-F1：5´-GGTTGGCTTTTGCTGTTGGT-3´；PRRSV-R1：5´-GGTCCCAAGGTTTGAGAAGCT-3´；特异性探针为P 2：5´-H E XCCCAGTCGGCAATGCTTGTGAGT -3´。

1.4　病毒核酸提取

按AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒使用说明书，提取CSFV和PRRSV的RNA，及PPV、JEV、PRV、PCV2等的核酸，并将其作为模板。

1.5　荧光RT-PCR检测方法的建立和优化

按照PrimeScript™ OneStep RT-PCR Kit Ver.2说明配置反应体系。体系总体积为25μL：2×1 Step Buffer 12.5 μL，CSFV-F1、CSFV-R1和P1、PRRSV-F2、PRRSV-R2和P2若干，PrimeScript™1 step Enzyme Mix 1.0 μL，模板RNA 2 μL，其余用RNase free dH2O补齐。离心数秒后，放入MyGo mini实时荧光定量PCR仪，进行实时PCR扩增，对荧光RT-PCR程序进行优化，同时对反应体系中的引物和探针浓度进行筛选，以获得最低CT值和较高的荧光强度增加值。

1.6　荧光RT-PCR灵敏度检测

参照文献[5-6]测定CSFV和PRRSV 的TCID50。将病毒培养液进行10倍系列稀释，各取100 μL病毒稀释液，经AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒抽提核酸后，进行荧光RT-PCR检测，重复3次，确定最低检测灵敏度。

1.7　荧光RT-PCR特异性、重复性试验

利用建立起的荧光RT-PCR法，分别对CSFV、PRRSV、CSFV和PRRSV混合毒，以及PPV、JEV、PRV、PCV2进行检测，以验证其特异性。对CSFV和PRRSV的细胞培养液分别做10倍系列稀释，每个梯度同时重复检测3次，记录CT值，然后分别计算CSFV和PRRSV组内检测变异系数。

1.8　临床样品检测

用建立的双重荧光定量RT-PCR法，对从山东省各地收集的173份临床疑似病料进行CSFV和PRRSV检测，同时用常规RT-PCR法及单重荧光定量RT-PCR法进行检测，比较三者的检测结果。

2　结果

2.1　荧光RT–PCR反应条件优化

优化结果表明，在25 μL反应体系中，扩增效果最佳的引物和探针浓度分别为：1 μL CSFV-F1（15 μmol/L），1.2 μLCSFV-R1（15 μmol/L），0.8 μLP1（5 μmol/L），1 μLPRRSV-F2（15 μmol/L），1.4 μLPRRSV-R2（15 μmol/L），1 μL P2（5 μmol/L）。优化后的反应程序为：50 ℃反转录10 min，95 ℃预变性2 min，95 ℃变性10 s，56 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s（此时收集荧光）。

2.2　荧光RT-PCR灵敏度

CSFV和PRRSV细胞培养液病毒滴度分别为105.4和106.3TCID50/100 μL。当CSFV等比稀释到10-6，即病毒滴度稀释到0.25TCID50/100 μL时，荧光RT-PCR扩增结果仍为阳性；当PRRSV等比稀释到10-6，即病毒滴度稀释到1.99TCID50/100 μL时，荧光RTPCR扩增结果仍为阳性。

2.3　特异性检验

按建立的方法，对CSFV、PRRSV、CSFV和PRRSV混合毒，以及PPV、JEV、PRV、PCV2的阳性样品进行荧光定量RT-PCR检测。结果显示：CSFV样品孔FAM荧光检测出现了单一的S型扩增曲线，说明CSFV疫苗毒株阳性；PRRSV样品孔HEX荧光检测出现了单一的S型扩增曲线，说明PRRSV阳性；CSFV和PRRSV混合毒样品孔FAM和HEX荧光检测均出现了单一的S型扩增曲线，说明CSFV和PRRSV均为阳性；其余样品孔FAM和HEX荧光检测均没有S型扩增曲线，表明建立的荧光RT-PCR检测方法特异性良好。

2.4　荧光RT-PCR重复性试验

利用建立的荧光RT-PCR法，对CSFV和PRRSV细胞培养液分别进行10倍系列稀释，每个梯度同时重复检测3次，记录CT值，然后分别计算CSFV和PRRSV组内、组间检测的变异系数，发现样品CT值、批内重复性试验CV值均小于2.0%，批间重复性试验CV值均小于1.0%，表明本方法的重复性好（表1）。

表1　实时荧光RT-PCR的组内和组间重复性实验结果

2.5　临床样品检测

分别用建立的双重荧光定量RT-PCR和普通RT-PCR方法，对临床收集的172份疑似CSFV样品进行检测，并与常规RT-PCR检测方法进行比较。双重荧光定量RT-PCR结果显示：172份病料中，35份为CSFV阳性，检出率为20.2%；68份PRRSV阳性，检出率为39.5%；7份CSFV和PRRSV均阳性。常规RT-PCR结果显示：172份病料中，28份为CSFV阳性，检出率为16.2%；57份PRRSV阳性，检出率为32.9%；6份CSFV和PRRSV均阳性（表2）。双重荧光定量RTPCR与常规RT-PCR符合率为82.6%。双重荧光定量RT-PCR与单重荧光定量RT-PCR的结果相同，二者符合率为100%。从临床检测结果看出，双重荧光定量RT-PCR检出率高于普通RT-PCR。

3　讨论

马超英等[7]建立了可以同时鉴别检测CSFV和PRRSV的双重RT-PCR方法。该方法能从CSFV和PRRSV分别扩增出310和161 bp的特异性片段，对2种病毒混合基因组同时扩增出310 bp和161 bp的特异性片段；该方法对JEV、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、PPV、PCV2、PRV的扩增结果均为阴性；该方法最低可以检出0.2 pg病毒RNA含量。成丹等[8]应用CSFV及北美洲型PRRSV特异性引物和TaqMan水解探针，建立一种同时检测CSFV和PRRSV的复合荧光定量RT-PCR方法。该方法可检测到3.2TCID50的CSFV和1.8TCID50的北美洲型PRRSV，比常规PCR方法敏感性高50倍以上。

表2　三种方法临床样品检测阳性率 单位：%

核酸提取是PCR检测的重要步骤。核酸提取的时间和质量对PCR检测的总时间和检测效果均有重要的影响。本研究采用商品化核酸试剂提取核酸，主要采用吸附柱式，操作简单、快速，提取时配合小型高速离心机，0.5 h即能完成提取。将经典Triol法与该法进行比对，发现检测结果一致，说明提取的RNA质量能完全满足检测要求。最重要的是该法的核酸提取时间远少于传统Triol法。与磁株法相比的优势是所需要试剂少，操作简单，试剂常温保存即可，贮存和运输不需要低温，适合现场检测。

本研究建立的CSFV和PRRSV一步法双重荧光RT-PCR检测方法，只需在PCR反应中加入反转录试剂即可，无需单独反转录时间，可大幅缩减反应所需时间，可在50 min内完成扩增反应，得出检测结果，不需特定实验室，无需电泳，比其他方法至少可节省1/2的时间和费用。该法操作简单，避免了由于多次操作及电泳而造成的污染问题，可检测微量病毒，并可将人为因素对结果的影响降到最低。试验所用的荧光定量PCR仪尺寸小、重量轻、便于携带，适合用于现场快速检测，从而节省送样时间和样品运送途中的损耗，进一步提高了检测准确性。为更加适用现场检测需求，本试验将对检测试剂的保存方式进行了优化。将所用检测试剂配制完成后，加入冻干保护剂，并分装到8联管中冻干保存，实现了常温保存和运输，使用时，只需要加入灭菌纯化水和模板，即能进行扩增反应。这样既简化加样步骤，又避免了操作过程的污染。

4　结论

本试验建立的CSFV和PRRSV一步法双重荧光RT-PCR检测方法，特异性好、灵敏度高、稳定性好，配合AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒，从核酸提取到报告检测结果仅需1.5 h，检测速度快，操作简便，适合现场快速检测。下一步利用该技术开发组装成试剂盒。该试剂盒市场预期较好，适合基层CSF和PRRS的临床快速诊断，可为制定相应的防治措施，以及精准评估和诊断母猪带毒排毒、仔猪潜在感染，检测母猪唾液、脐带血中CSFV、PRRSV含量等提供技术支持，从而为CSF和PRRS的预警、疫苗免疫效果评估及防控净化提供技术条件。

参考文献：

[1] 仇华吉，童光志，沈荣显. 猪瘟兔化弱毒疫苗——半个世纪的回顾[J]. 中国农业科学，2005（8）：1675-1685.

[2] 于新友，李天芝，苗立中，等. 分子生物学技术在猪瘟野毒与兔化弱毒鉴别诊断方法中的研究进展[J]. 猪业科学，2015，32（1）：76-78.

[3] 涂长春. 猪瘟国际流行态势、我国现状及防制对策[J].中国农业科学，2003（8）：955-960.

[4] 苏晓鸥，李玉荣，乔俊文，等. 猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）检测方法的建立[J]. 河北农业大学学报，2009，32（1）：82-85.

[5] 戴志红，蒋卉，李翠，等. 用间接免疫荧光检测方法评价猪瘟兔化弱毒活疫苗效力的研究[J]. 中国兽药杂志，2014，48（1）：34-37.

[6] 孟日增，刘金华，孟庆峰，等. 猪繁殖与呼吸综合征病毒ZB株的分离与鉴定[J]. 黑龙江畜牧兽医，2015（17）：171-173.

[7] 马超英，李宗文. 猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒双重RT-PCR检测方法的建立[J].动物医学进展，2013，34（9）：71-75.

[8] 成丹，赵建军，李娜，等. 同时检测猪瘟病毒和北美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的复合荧光定量RTPCR方法的建立[J]. 畜牧兽医学报，2009，40（1）：72-77.