口蹄疫、猪瘟、高致病性猪繁殖与呼吸综合征三种疫苗同步两点免疫的临床应用

施开创，覃　勇，尹彦文，唐云姣，黄百花

（1. 广西动物疫病预防控制中心，广西南宁　530001；2. 百色市动物疫病预防控制中心，广西百色　533000）

口蹄疫（Foot-and-mouth disease，FMD）、猪瘟（Classical swine fever，CSF）、高致病性猪繁殖与呼吸综合征（Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome，HP-PRRS）是当前严重危害养猪业的重要疫病。2017年前，我国对FMD、CSF和HP-PRRS实行强制免疫，2017年后只对FMD实行强制免疫，而对CSF和HP-PRRS实行全面免疫[1]。为提高免疫效果，许多学者开展了FMD、CSF、HP-PRRS疫苗不同免疫程序的免疫效果研究[2-7]。有研究发现，在原有“333法”免疫程序（即FMD、CSF、HP-PRRS疫苗先后间隔14 d免疫注射）基础上开展的“332法”（即先用FMD灭活疫苗和CSF弱毒疫苗同时在颈部分点免疫注射，间隔14 d后再用HP-PRRS弱毒疫苗免疫注射）和“321法”免疫程序（即将HP-PRRS弱毒疫苗和CSF弱毒疫苗释稀后混合为一针，将FMD灭活疫苗单独为一针分别在颈部两侧同时分点注射）均有更好的免疫效果[8]，且“321法”优于“332法”[9-10]。本研究在小规模试验基础上，于2014—2016年在广西省百色市12个县（市、区）135个乡镇进行了3种不同免疫程序的较大规模临床试验，以便为临床大面积推广应用提供依据。

1　材料与方法

1.1　疫苗

所使用疫苗为2014—2016年广西政府招标采购疫苗。FMD O型灭活疫苗（OMYA98/BY/2010株）：中农威特生物科技股份有限公司、内蒙古必威安泰生物科技有限公司、新疆天康生物科技股份有限公司生产；CSF弱毒疫苗（细胞源）：成都天邦生物制品有限公司、广西丽原生物股分有限公司生产；HP-PRRS弱毒疫苗（TJM-F92株）：吉林特研生物技术有限责任公司、新疆天康生物科技股份有限公司生产。每年均用同一厂家生产的疫苗。

1.2　主要试剂

FMD O型抗体液相阻断ELISA试剂盒：中国农业科学院兰州兽医研究所产品；猪瘟（CSF-Ab）抗体检测试剂盒：韩国金诺公司产品；猪繁殖与呼吸综合征抗体ELISA检测试剂盒：法国LSI公司产品；口蹄疫病毒通用型RT-PCR检测试剂盒、猪瘟病毒通用型RT-PCR检测试剂盒、猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测试剂盒：北京世纪元亨动物防疫技术有限公司产品。

1.3　试验设计

免疫方式以春季、秋季集中免疫为主，常年定期补免为辅。2014—2016年在广西百色市12个县（市、区）135个乡镇，根据地理位置和养殖规模、养殖习惯等情况，每个县（市、区）随机选取不同乡镇，分别采用“333法”“332法”“321法”进行免疫（免疫剂量均为1 mL/头份）。

血清样品来源于每年春秋两季集中强制免疫后，对辖区所有12个县（市、区）进行验收时随机采集的样品。分别采集应用“333法”“332法”“321法”免疫的血清2 799、5 180、4 114份。组织样品（心、肝、脾、肺、肾、扁桃体、淋巴结等）来源于百色市12个县（市、区）异常死亡猪。分别采集应用“333法”“332法”“321法”免疫程序的组织样品383、1 167、595份。血清、组织样品置-20 ℃保存备用。

1.4　血清抗体检测

血清抗体检测均按照相应检测试剂盒说明书进行。FMD O型病毒抗体判断标准：对照临界值，抗体效价＜1:64时判为阴性，1:64时判为可疑，≥1:128时判为阳性。CSF病毒抗体判定标准：PC＜40%时判为阴性，≥40 %时判为阳性。HPPRRS病毒抗体判定标准：IRPC≤20时判为阴性，＞20时判为阳性。

1.5　组织样品病原检测

组织样品的病原检测均按照相应检测试剂盒说明书进行。被检样品出现131 bp扩增带时判为FMD阳性，否则为阴性；被检样品出现235 bp扩增带时判为CSF阳性，否则为阴性；被检样品出现278 bp扩增带时判为HP-PRRS阳性，否则为阴性。

1.6　数据统计与分析

收集百色市12个县（市、区）的生猪免疫数、发病数、死亡数（包括病死数、发病淘汰数）、免疫副反应数。利用Excel 2007进行数据统计，采用单因素方差分析法，对各种数据进行差异性分析。当P＜0.05时，判为差异显著。

2　结果

2.1　免疫密度

百色市各县（市、区）135个乡镇2014—2016年应用“333法”的FMD、CSF、HP-PRRS平均免疫密度分别为97.20%、95.27%、83.89%，应用“332法”的平均免疫密度分别为95.28%、95.28%、90.92%，应用“321法”的平均免疫密度均为96.24 %。与“333法”相比，“332法”和“321法”的HP-PRRS免疫密度均显著提高（P＜0.05）、FMD和CSF的免疫密度则差异不显著（P＞0.05）；与“332法”免疫程序相比，“321法”的HP-PRRS免疫密度显著提高（P＜0.05），FMD和CSF免疫密度稍有提高，但差异不显著（P＞0.05），具体结果见表1。

表1　FMD、CSF、HP-PRRS疫苗免疫密度 单位：%

2.2　抗体检测

对百色市各县（市、区）春秋集中强制免疫质量验收时所采集的血清，应用ELISA方法进行抗体检测。结果显示：应用“333法”的FMD、CSF和HP-PRRS抗体阳性率分别为90.10%、89.10%、86.17%；应用“332法”的分别为94.25%、90.62%、90.58%；应用“321法”的分别为94.46%、91.66%、91.27%。与“333法”相比，“332法”和“321法”的HP-PRRS抗体阳性率均显著提高（P＜0.05），FMD和CSF抗体阳性率有所提高，但差异不显著（P＞0.05），具体结果见表2。

表2　FMDV、CSFV和HP-PRRSV抗体检测结果 单位：%

2.3　病原检测

应用RT-PCR方法，对从百色市各县（市、区）采集的病死猪组织样品进行病原检测。结果显示：3种不同免疫程序的FMD病原检测均为阴性；与“333法”相比，“332法”和“321法”的CSF病原阳性率均有所降低，但差异不显著（P＞0.05），而HP-PRRS阳性率则显著降低（P＜0.05）；“321法”与“332法”相比，CSF、HPPRRS病原阳性率有所下降，但差异不显著（表3）。

表3　FMD、CSF和HP-PRRS病原检测结果　单位：%

2.4　生猪发病率、死亡率和免疫副反应率

经统计百色市各县（市、区）数据，与“333法”相比，应用“332法”和“321法”的生猪发病率、死亡率均显著降低（P＜0.05），而免疫副反应率稍有增加，但差异不显著（P＞0.05）；“321法”与“332法”相比，发病率、死亡率显著下降（P＜0.05），而免疫副反应率有所增加，但差异不显著（P＞0.05）（表4）。

表4　生猪的发病率、死亡率和免疫副反应率　单位：%

2.5　综合评价

综合分析各项考核指标发现，与“333法”免疫程序相比，“332法”和“321法”的HP-PRRS免疫密度及其抗体阳性率显著提高，HP-PRRS病原阳性率、生猪发病率、死亡率显著下降；与“332法”相比，“321法”的HP-PRRS免疫密度显著提高，病原阳性率以及生猪发病率、死亡率显著下降（表5）。结果表明，3种免疫程序对FMD和CSF的免疫效果差异不大，而对HP-PRRS的免疫效果则显著提高，总体而言，“332法”和“321法”均优于“333法”，而“321法”又优于“332法”。

3　讨论

许多学者为简化免疫程序，减少免疫次数，提高免疫效果，针对FMD、CSF、HP-PRRS疫苗开展了大量免疫试验。张长龙等[2]采用3种疫苗同时分点免疫，发现3种疫苗间相互干扰较大，CSF抗体产生时间推迟；而先接种CSF疫苗，7 d后接种FMD和HP-PRRS疫苗，后两者具有协同促进作用。窦鹏勋等[3]报道，CSF、FMD、HPPRRS疫苗同时免疫可取得理想的免疫效果，FMD与HP-PRRS疫苗同时免疫具有协同作用，CSF和HP-PRRS疫苗同时免疫会相互影响。马睿麟等[4]报道，CSF和HP-PRRS疫苗组合免疫，7 d后免疫FMD疫苗，发现FMD抗体较低；先免疫CSF疫苗，7 d后免疫FMD和HP-PRRS疫苗，CSF抗体受到干扰；FMD、CSF和PRRS 3种疫苗同时分点免疫或单独免疫，免疫效果一致。任宇斓等[5]用FMD、CSF、HP-PRRS疫苗同时分点注射以及3种疫苗间隔7 d免疫注射，均取得了理想的免疫效果。卢景等[6]报道，FMD、CSF和HP-PRRS 3种疫苗同时分点免疫的抗体水平都低于单独免疫；FMD和HP-PRRS疫苗或CSF和HP-PRRS疫苗同时分点免疫，均会相互干扰，但对7 d后免疫的CSF疫苗或FMD疫苗没有影响；FMD和CSF疫苗同时分点免疫，7 d后再免疫HP-PRRS疫苗，产生的抗体效价与3种疫苗单独免疫基本一致。陈文武等[7]报道，先免疫HP-PRRS疫苗，7 d后同时分点注射FMD和CSF疫苗，或者CSF、FMD、HP-PRRS 3种疫苗同时分点免疫注射，均会获得较好的免疫效果；CSF和FMD同时免疫具有协同作用，CSF和HP-PRRS或FMD和HP-PRRS同时免疫会相互影响。以上报道与本研究结果并不完全一致。这可能与不同地域的气候条件，饲养管理，猪的品种、年龄、健康状况，疫苗种类，免疫程序，猪群基础免疫，母源抗体水平等多种因素有关。

表5　“332法”“321法”与“333法”免疫程序各项考核指标比较

本研究选取的百色市地处广西西部，与越南毗邻，处于丘陵地带；12个县市的气候条件相似，养殖习惯、养殖特点、猪群品种、饲养管理水平也基本相同。为避免疫苗种类对不同免疫程序免疫效果影响，百色市每年所使用的疫苗均为同一厂家疫苗。但在生产实践中，难以完全控制其他因素。因此，本研究在采集血清和病料样本时，尽可能扩大采样的地域范围、时间分布，增加采样数量，以降低各种因素对免疫效果的影响。本研究结果显示，3种免疫程序中，FMD和CSF的免疫效果没有显著差异，而HP-PRRS的免疫效果则有显著差异。究其原因，是因为提高了HP-PRRS免疫密度，减少了应急因素。广西边境地区原来应用的是“333法”，需要抓3次猪，进行3次免疫。畜主因担心多次抓猪会引起应激反应、免疫副反应等而影响生产性能，出现抵触甚至拒绝后面的疫苗免疫，加上部分基层防疫人员责任心不强，导致免疫存在空白点，影响了免疫密度。本研究示范应用的“332法”和“321法”免疫程序，减少了抓猪和免疫注射次数，养殖户乐于接受和配合，因而提高了免疫密度。HP-PRRS免疫密度的提高，有效减少了HP-PRRS的临床发病率和死亡率。本研究显示，即使经过疫苗免疫，仍可在病死猪组织中检测到CSF和HP-PRRSV，说明免疫猪群中仍有CSF和HP-PRRS病原的存在和循环，因此必须对此高度重视，尤其是HP-PRRSV野毒株的感染[11-12]。

4　结论

本研究显示，对于FMD和CSF而言，“333法”“332法”和“321法”免疫程序间的免疫密度、抗体阳性率、病原阳性率差异不显著，即3种免疫程序的免疫效果相当；对HP-PRRS而言，这3种免疫程序间的免疫密度、抗体阳性率、病原阳性率、生猪发病率和死亡率差异显著，“321法”的免疫效果最好。其原因主要是由于HP-PRRS免疫密度的提高，以及总免疫次数的减少，降低了生猪发病率、死亡率，减少了应激刺激。临床上，可以根据实际情况优先选择应用“321法”，其次可选择应用“332法”免疫程序。

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