高脂血症大鼠下颌下腺水通道蛋白2和4的表达

杨玥欣　沈夏波　武雅静　桂　丽　贾雪梅

(安徽医科大学第二临床医学院，安徽　合肥　230032)

研究发现高脂血症患者伴随有口渴的症状，这可能与下颌下腺的唾液分泌功能异常有关〔1〕。水通道蛋白(AQPs)是一类具有转运水和其他小分子可溶物的蛋白质家族，在唾液分泌过程中起重要作用。AQP2是唯一一种功能受控的AQP5，AQP5可能是AQP2表达的校准器〔2〕。高脂血症大鼠下颌下腺中AQP5的表达存在异常〔1〕，但AQP2 的表达是否随之改变还未阐明。AQP4可在细胞间快速转运水，且该作用受AQP4四聚体结构的阻碍〔3〕。AQP4在高脂血症患者下颌下腺的表达变化也不清楚。本实验观察高脂血症组大鼠下颌下腺AQP2和AQP4的表达变化。

1　材料和方法

1.1试剂AQP2和AQP4的抗体(武汉博士德生物技术有限公司)、SP 免疫组织化学试剂盒及二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2高脂血症动物模型复制雄性SD大鼠20只，体质量110～160 g，安徽医科大学实验动物中心提供，普通级，随机分为两组，每组10只。对照组予以全价饲料喂养；高脂血症组给予高脂饮食(胆固醇 2%、 猪油10%、 基础饲料 88%)，复制高脂血症模型；连续观察2个月，各组动物均不限制饮食和饮水。

1.3标本制备用20%乌拉坦1 ml/100 g，腹腔注射，麻醉后剖开腹腔，下腔静脉取血，行三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)检测；取下颌下腺固定于10%甲醛溶液，常规石蜡包埋，切片4 μm。

1.4苏木素-伊红(HE)染色切片脱蜡至水，入苏木精染色15 min，再进行盐酸乙醇分色、蓝化、伊红染色、脱水、透明和封片，显微镜下观察下颌下腺病理学改变。

1.5免疫组化染色石蜡切片常规脱蜡至水，柠檬酸盐缓冲液修复，微波炉高火8 min，静置3 min，再高火4 min，冷却至室温。3%H2O2，37℃孵育20 min；滴加AQP2一抗溶液(1∶200)和AQP4一抗溶液(1∶100)，滴加50 μl磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照，4℃过夜，切片从冰箱取出恢复至室温；滴加二抗(生物素标记的山羊抗兔的IgG)，37℃孵育30 min；辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育30 min。以上步骤之间都以PBS冲洗3次×3 min。滴加DAB显色3 min。自来水冲洗；苏木精复染，放入自来水中蓝化，脱水，透明和封片。在10×40倍光镜下，利用Nikon彩色数码CCD摄像头捕获各组切片中AQP2和AQP4的图像，每张切片随机选取6个视野，再用捷达生物图像软件计算各组AQP2和AQP4免疫阳性细胞的平均光密度值(MOD)。

1.6统计学方法采用SPSS17.0软件进行t检验。

2　结　果

2.1两组血脂水平比较对照组TG〔(0.784 8±0.212 7)mmol/L〕、TC〔(1.250 6±0.353 9)mmol/L〕水平明显低于高脂血症组〔(2.761 8±0.526 0)mmol/L、(5.822 3±0.981 9)mmol/L，P<0.05〕。

2.2两组下颌下腺病理学观察对照组大鼠腺泡饱满，结构清晰。高脂血症组大鼠腺泡萎缩，直径变小，可见结缔组织增生，见图1。

2.3两组下颌下腺AQP2免疫组化表达对照组和高脂血症组大鼠下颌下腺AQP2都呈阳性，大多呈棕褐色。在黏液性腺泡区，AQP2免疫阳性反应物主要沉积于纹状管导管上皮胞质内；在浆液性腺泡区，AQP2主要在纹状管表达，腺泡中也有表达，而颗粒曲管中则无表达，见图2。对照组(0.926 1±0.066 2)和高脂血症组下颌下腺AQP2表达差异无统计学意义(0.981 9±0.177 9,P>0.05)。

2.4两组下颌下腺AQP4免疫组化表达在黏液性腺泡区，对照组、高脂血症组下颌下腺AQP4免疫阳性反应物主要沉积在纹状管导管上皮细胞，呈棕褐色；在浆液性腺泡区，AQP4主要表达在纹状管，腺泡中也有表达，但颗粒曲管中无表达，见图3。与对照组(1.098 6±0.083 4)相比，高脂血症组AQP4免疫阳性反应物表达明显减弱(1.009 8±0.086 6,t=2.374,P<0.05)，呈浅棕黄色。

图1　两组下颌下腺黏液性、浆液性腺泡区组织结构(HE，×400)

图2　两组下颌下腺黏液性、浆液性腺泡区AQP2表达(DAB，×400)

图3　两组下颌下腺黏液性、浆液性腺泡区AQP4表达(DAB，×400)

3　讨　论

AQP2主要表达在肾脏结合小管和集合管的主细胞，与糖尿病肾病关系密切〔2,4,5〕。本文结果显示，与正常大鼠比较，高脂血症大鼠下颌下腺AQP2的表达无明显变化。AQP2的量和细胞定位受到多种激素和信号分子的影响，包括精氨酸加压素(AVP)。高钠血症或低血容量时，AVP从垂体后叶分泌到血流中〔6〕，它促成细胞内从小囊泡到顶膜的AQP2水通道蛋白的重新分配〔7〕，增强水的重吸收及其跨膜转运〔5〕。AVP受体主要存在于全身血管平滑肌、肾脏远端后端和集合管上皮细胞以及中枢神经系统〔8〕，而目前尚未有AVP受体在大鼠下颌下腺中表达的报道。据此推测，AVP受体在大鼠下颌下腺中表达含量过低或不表达可能导致高脂血症大鼠AQP2的表达不受影响。AQP4广泛分布于体内，包括中枢神经系统、肾、肺、结肠，也可在支气管上皮表达〔9〕。有实验证明AQP4在干燥综合征大鼠下颌下腺表达〔10〕，AQP4是维持下颌下腺水平衡的重要水通道蛋白，在唾液形成的过程中有重要的作用。本文显示与正常大鼠比较，高脂血症大鼠下颌下腺AQP4的表达明显下降，据此推测，AQP4表达减少会导致下颌下腺导管对水的转运功能下降，引起唾液的分泌量减少，这可能是导致高脂血症患者口渴的原因之一。AQP4表达减少的原因可能有：①缺血缺氧使AQP4的表达发生改变。据报道，缺氧/缺血 24 h后，大脑组织中血管和突触周围星形胶质细胞足突上的AQP4 表达下降，使星形胶质细胞死亡〔11〕。而高脂血症的直接损害是加速全身动脉粥样硬化，一旦动脉被粥样斑块堵塞，就会导致局部组织如下颌下腺缺氧缺血，引起AQP4 表达下降。②高脂血症时游离的脂肪酸和TG的升高导致胰岛素抵抗，下颌下腺组织出现葡萄糖代谢障碍，导致AQP4合成能量不足，AQP4表达下降。③蛋白激酶C和MAPKs信号通路参与AQP4的表达调节〔12〕，有研究表明在高脂血症大鼠的胰腺中蛋白激酶C活化，据此推测，蛋白激酶C激活可以抑制下颌下腺中的AQP4基因的表达，减少mRNA的产生〔13〕。而高脂血症大鼠血液中的TG和TC的慢性刺激可诱导蛋白激酶C的活化，使下颌下腺AQP4表达减少。④根据翻译起始处蛋氨酸M1和M23的不同，将AQP4分为两个亚型，内源性AQP4是同时含有M1(含 323 个氨基酸 )和M23(含有 301 个氨基酸)的四聚体，它们共同组成四聚体存在于细胞膜上〔14〕。高脂血症大鼠下颌下腺中也可能由于AQP4亚型结合的比例失调，导致表达的下降，使其转运水的功能发生改变。

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9丁建中，贺尚荣，张燕翔，等.水通道蛋白4在外燥小鼠肺组织表达的实验研究〔J〕.长江大学学报(自然科学版)，2010；7(3)：1-2；28.

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