N-乙酰半胱氨酸对人脐静脉内皮细胞eNOS的保护作用

王凌霄　王阿磊　丁　菁　张　倩　黄　华　姜君财　陆德琴

(贵州医科大学病理生理学教研室，贵州　贵阳　550025)

内皮功能障碍(ED)是心血管疾病发生发展的共同始动因素，氧化应激损伤是导致ED的主要原因之一〔1〕。生理情况下血管内皮细胞分泌的一氧化氮(NO)在维持血管稳态中起着重要的作用，NO在一氧化氮合酶(NOS)的催化下产生，主要来源于内皮型NOS(eNOS)。ED的重要表现之一是eNOS/NO功能受损，其机制可能与eNOS活性下降及NO生物利用度降低有关。蛋白磷酸酶(PP)2A是目前已知还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶(Nox)源性活性氧(ROS)的主要靶蛋白之一，也是使eNOS Ser1177/1179去磷酸化的主要磷酸酶〔2〕。研究发现N-乙酰半胱氨酸(NAC)作为一种ROS清除剂可以减轻氧化应激，对血管形态及功能起到保护作用〔3〕。血管紧张素(Ang)Ⅱ可通过多种途径产生大量的ROS，从而造成ED〔4〕。本研究对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)给予AngⅡ刺激，同时使用NAC对HUVECs进行预处理，初步探讨NAC预处理对内皮细胞eNOS活性的保护作用及机制。

1　材料和方法

1.1实验试剂及仪器HUVECs由贵州医科大学曾柱教授惠赠；胎牛血清(FBS)、无酚红高糖DMEM培养基(Gibco)；高糖DMEM培养基、青-链霉素、0.25%胰蛋白酶(HyClone)；NAC、AngⅡ(Sigma)；聚氟偏乙烯(PVDF)蛋白杂交膜(Millipore)；电化学发光法(ECL)增强化学发光试剂盒(Bio-Rad)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(Thermo)；鼠抗人eNOS抗体(BD)；兔抗鼠eNOS Ser1177抗体(Millipore)；兔抗鼠PP2A-c Y307抗体(Abcam)；兔抗鼠PP2A-Cα抗体、羊抗兔I2PP2A抗体、兔抗鼠β-tubulin抗体、辣根过氧化酶标记的羊抗兔Ⅱ抗、羊抗鼠Ⅱ抗、兔抗羊Ⅱ抗(Santa Cruz)；兔抗人Ⅷ因子相关抗原抗体、兔抗人CD34抗体(北京博奥森生物公司)；链霉亲合素-生物素复合物(SABC)法检测试剂盒(北京中杉金桥公司)；BX41显微镜、倒置荧光显微镜(OLYMPUS)；ROS检测试剂盒(碧云天)；NOS分型测定及NO测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2HUVECs细胞培养HUVECs接种于无菌25 cm2培养瓶中，于37℃、5 %CO2的培养箱中用含10% FBS高糖DMEM培养基培养，每48 h更换一次培养液，当细胞生长达到80%左右时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，进行传代。实验取4～10代的细胞。

1.3细胞鉴定细胞爬片后，于六孔板中培养。待密度至50%左右时，用无FBS培养基静止12 h，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次后，采用4%多聚甲醛固定，用兔抗人Ⅷ因子相关抗原抗体和兔抗人CD34抗体作为Ⅰ抗，1∶100稀释后，SABC法进行免疫细胞化学染色。PBS培养作为阴性对照。镜下胞质内出现棕黄色颗粒者为阳性细胞。200倍显微镜下随机取5个视野计数阳性细胞，阳性细胞率(%)=阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.4分组

1.4.1单纯AngⅡ处理实验HUVECs随机分为正常对照组和AngⅡ组(AngⅡ浓度分别为1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L，处理12 h)。通过Western印迹检测eNOS Ser1177磷酸化水平，AngⅡ最终使用浓度取1×10-7mol/L和1×10-6mol/L，处理时间12 h进行实验。

1.4.2NAC预处理实验根据参考文献〔5〕，采用终浓度为1×10-3mol/L的NAC预处理1 h，随机分为正常对照组、AngⅡ(1×10-7mol/L和1×10-6mol/L，处理12 h)组、单纯NAC组、NAC(预处理)+AngⅡ(1×10-7mol/L、1×10-6mol/L)组。

1.5细胞内ROS的测定于六孔板中培养HUVECs，随机分为正常对照组和AngⅡ组，作用12 h后去除细胞培养液，加入1.5 ml终浓度为10 μmol/L的荧光探针二氯荧光磺双乙酸盐(DCFH-DA，使用无FBS培养基稀释)，于37℃、5%CO2的培养箱内孵育20 min，用无FBS培养基洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。使用488 nm激发波长、525 nm发射波长于倒置荧光显微镜观察荧光并拍照，采用Image J软件分析DCF的荧光强度。

1.6Western印迹检测蛋白水平分别收集各组细胞，加入蛋白裂解液，冰上刮取细胞后裂解30 min，4℃、12 000 r/min离心取上清，BCA法测定蛋白浓度，其余蛋白变性后十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳，上样，转膜，5%脱脂牛奶常温封闭1 h，Tris盐酸缓冲液(TBST)洗膜后孵育Ⅰ抗4℃过夜。次日TBST洗膜后，加入Ⅱ抗，常温孵育1 h，TBST洗膜，ECL显影曝光。用Bio-Rad凝胶成像系统软件分析蛋白条带相对积分吸光度值。

1.7化学比色法检测HUVECs中细胞组成型一氧化氮合酶(cNOS)活性细胞处理完毕后使用0.25%胰蛋白酶消化，采用含10% FBS的高糖DMEM培养基终止消化，重悬，1 000 r/min离心5 min，得细胞沉淀。加入适量PBS洗涤细胞，1 000 r/min离心6 min，弃上清，重复洗涤2次。在细胞沉淀中加入300 μl的PBS，混匀，超声粉碎细胞，取上清进行蛋白浓度测定和cNOS检测。所有检测均复6孔。

1.8化学比色法检测HUVECs培养基中NO含量细胞处理完毕后分别对应收集各组培养基，按试剂盒说明书添加试剂一和二，混匀后于酶标仪550 nm波长处测各组A值。所有检测均复6孔。

1.9统计学方法应用SPSS17.0软件，计量资料样本均数比较前先进行方差齐性检验，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，多组间两两比较采用SNK-q法。

2　结　果

2.1细胞鉴定结果免疫组织化学染色结果显示，在培养的HUVECs中，Ⅷ因子相关抗原和CD34表达阳性，阴性对照组未见胞质黄染，计算阳性细胞率为100%。见图1。

A：Ⅷ因子相关抗原阴性对照；B：HUVECs中Ⅷ因子相关抗原阳性表达；C：CD34阴性对照；D：HUVECs中CD34阳性表达图1　Ⅷ因子相关抗原和CD34在HUVECs中的表达(SABC,×200)

2.2AngⅡ刺激HUVECs后下调eNOS Ser1177磷酸化水平各剂量AngⅡ刺激HUVECs 12 h后，与正常对照组比较及各组间eNOS蛋白表达比较差异均无统计学意义(P>0.05)，各剂量AngⅡ组eNOS Ser1177磷酸化水平均明显低于正常对照组(P<0.05)，AngⅡ各组间eNOS Ser1177磷酸化水平差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

1:正常对照组；2:AngⅡ10-9mol/L组；3:AngⅡ10-8mol/L组；4:AngⅡ10-7mol/L组；5:AngⅡ10-6mol/L组；6:AngⅡ10-5mol/L组;与正常对照组相比:1)P<0.05图2　AngⅡ刺激HUVECs 12 h后各组eNOS蛋白表达及eNOS Ser1177磷酸化水平的变化

2.3AngⅡ刺激HUVECs后增加ROS的产生AngⅡ(1×10-7mol/L、1×10-6mol/L)刺激HUVECs 12 h后，DCF荧光强度与正常对照组比较明显增加(P<0.05)。见图3。

与正常对照组比较：1)P<0.05图3　AngⅡ刺激HUVECs 12 h后细胞中DCF的荧光强度(×200)

2.4NAC预处理增加eNOS Ser1177磷酸化水平各组间eNOS蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)，AngⅡ10-7mol/L组、AngⅡ10-6mol/L组与正常对照组比较eNOS Ser1177磷酸化水平明显降低(P<0.05)；与同浓度AngⅡ组比较，NAC预处理后eNOS蛋白表达差异仍无统计学意义(P>0.05)，eNOS Ser1177磷酸化水平明显增加(P<0.05)。AngⅡ各浓度组间、NAC预处理+AngⅡ各浓度组间比较，上述指标变化差异均无统计学意义(P>0.05)。见图4。

1:正常对照组；2：AngⅡ10-7mol/L组；3:AngⅡ10-6mol/L组；4:NAC组；5：NAC+AngⅡ10-7mol/L组；6：NAC+AngⅡ10-6mol/L；与正常对照组比较，1)P<0.05；与AngⅡ10-7mol/L组组比较，2)P<0.05；与AngⅡ10-6mol/L组比较，3)P<0.05；下图、下表同图4　NAC预处理对AngⅡ刺激HUVECs后各组eNOS蛋白表达及eNOS Ser1177磷酸化水平的影响

2.5NAC预处理增加PP2A-c Y307磷酸化水平和I2PP2A蛋白表达水平AngⅡ刺激后PP2A-Cα蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)，PP2A-c Y307磷酸化水平、I2PP2A蛋白表达水平明显降低(P<0.05)；与同浓度AngⅡ组比较，NAC预处理后PP2A-Cα蛋白表达差异仍无统计学意义(P>0.05)，PP2A-c Y307磷酸化水平、I2PP2A蛋白表达水平明显增加(P<0.05)。各浓度AngⅡ组间、NAC+AngⅡ各浓度组间比较上述指标变化均无统计学意义(P>0.05)。见图5。

图5　NAC预处理对AngⅡ刺激HUVECs后各组PP2A-Cα、I2PP2A蛋白表达和PP2A-c Y307磷酸化水平的影响

2.6NAC预处理增加细胞cNOS活性及培养基中NO的含量AngⅡ刺激后，cNOS活性、培养基中NO含量均明显降低(P<0.05)；与同浓度AngⅡ组比较，NAC预处理后cNOS活性、培养基中NO含量均明显增加(P<0.05)。AngⅡ各浓度组间、NAC+AngⅡ各浓度组间比较，cNOS活性、NO含量差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1　各组cNOS活性和培养基中NO含量的变化

3　讨　论

氧化应激发生时，ROS产生增多，可导致内皮细胞损伤。因此，减少氧化应激，改善内皮细胞功能，已经成为防治心血管疾病的研究热点。

eNOS活性调控的机制之一是其多个丝/苏氨酸位点的磷酸化，其中eNOS Ser1177/1179磷酸化上调可使eNOS活性增强，NO产生增多〔6〕。cNOS包括神经元型NOS(nNOS)和eNOS，因此cNOS活性本应是两者活性之和。但研究发现，血管内皮细胞主要以eNOS表达为主〔7〕，且本课题组前期使用免疫组化的方法证实nNOS在血管内皮细胞中表达很低〔8〕，故本研究中测定的cNOS活性可以代表eNOS活性。

AngⅡ刺激后可产生大量ROS，通过抑制蛋白激酶B(Akt)/eNOS信号途径，从而下调eNOS 1177磷酸化水平，造成血管内皮功能障碍〔9〕。本研究结果提示AngⅡ刺激可产生大量的ROS，eNOS Ser1177磷酸化水平下调，从而发生内皮功能紊乱。研究表明Akt可以上调eNOS Ser1177/1179磷酸化水平〔10〕；且有报道PP2A是Nox源性ROS的靶蛋白之一，而PP2A可使Akt、eNOS Ser1177〔2〕发生去磷酸化。PP2A是一种丝/苏氨酸蛋白磷酸酶，可使蛋白质脱磷酸，在PI3K/Akt/eNOS信号通路中起负性调控作用〔11〕。PP2Ac高度保守C端尾巴可发生翻译后磷酸化和甲基化修饰，磷酸化可发生在Tyr307上，抑制PP2A酶活性〔12〕。PP2A包括I1PP2A和I2PP2A两种胞内具有特异性、非竞争性和热稳定性的抑制蛋白〔13〕。Li等〔14〕从牛肾抽提物中纯化出I2PP2A蛋白，能显著抑制PP2A的活性。因此本研究主要检测PP2A-c Y307磷酸化水平和I2PP2A蛋白表达水平，作为对PP2A活性的判断。结果显示，AngⅡ刺激产生了大量的ROS，可能通过下调PP2A-c Y307和I2PP2A水平激活PP2A，PP2A可间接通过Akt去磷酸化或直接作用从而下调eNOS Ser1177磷酸化水平，降低eNOS活性及培养基中NO含量，最终导致内皮细胞功能受损。

NAC是含巯基的谷胱甘肽(GSH)的前体，作为一种ROS清除剂，具有清除氧自由基的作用，可以改善内皮细胞功能障碍。研究发现，在HUVECs中使用NAC可清除ROS，通过激活Akt/eNOS信号通路，从而上调eNOS 1177磷酸化水平〔15〕。本研究结果显示，NAC预处理可能通过清除ROS，激活Akt/eNOS信号通路，从而发挥保护eNOS活性的作用。有研究报道，在人类前列腺细胞株DU145中使用NAC清除ROS后，可抑制PP2A活性，进而激活PI3K/Akt信号通路〔16〕。在研究成纤维细胞自噬过程中，使用NAC清除ROS后可通过抑制半胱氨酸残基的亚磺酰化作用，从而降低PP2A活性，且此过程中检测到PP2A-c Y307磷酸化水平增加〔17〕。本研究结果显示，NAC预处理可能通过减少ROS生成，上调PP2A-c Y307和I2PP2A使PP2A活性降低，从而上调eNOS Ser1177磷酸化水平，增加eNOS活性，进而发挥保护内皮细胞的作用。

综上，AngⅡ可能通过降低PP2A-c Y307和I2PP2A使PP2A活性增加，最终导致eNOS活性降低；NAC预处理可通过增加PP2A-c Y307和I2PP2A，从而降低PP2A活性，发挥保护内皮细胞eNOS活性的作用。

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4Wei X,Zhu X,Hu N,etal.Baicalin attenuates angiotensin Ⅱ-induced endothelial dysfunction〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2015;465(1):101-7.

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