2014-2016年四川省疟疾诊断参比实验室结果比较*

2018-04-04邹晏李黎郁涛吴小红刘阳

四川生理科学杂志 2018年1期

邹晏　李黎　郁涛　吴小红　刘阳

(四川省疾病预防控制中心，四川成都　610041)

疟疾是全球广泛关注并严重危害人类健康的重要虫媒传染病。寄生于人体的疟原虫包括：间日疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫。根据世卫组织2016年12月公布的最新估算数据，2015年至少有2.12亿疟疾病例，42.9万人死亡，多数病例和死亡发生在撒哈拉以南的非洲。然而，东南亚、拉丁美洲以及中东地区也相应受到影响。2015年，91个国家和地区有持续性的疟疾传播[1]。疟疾曾是四川省的主要公共卫生问题，解放初期发病率达87.4/万。新中国成立后随着防治工作进程，流行强度逐渐减弱，流行面逐渐缩小，1994年以来疟疾发病率均在1/万以下，2001年后稳定在1/10万以下，2011年后我省已没有本地病例报告[2-6]。

随着四川省对外交流的逐年扩大，特别是近年来赴非洲、东南亚等疟疾高流行区务工人员较多，导致输入性疟疾疫情形势严峻， 2014年、2015年四川省输入性疟疾病例数位居全国第3位，2015年四川省恶性疟死亡病例数居全国第2位。这些归国劳务人员输入的疟疾，给全省疟疾防控工作带来严峻的考验。同时，疫情流行也出现了新的特征。以前本地疫情主要以间日疟为主，而目前的输入病例，恶性疟占很大比例。

2013年4月，四川省启动全省消除疟疾考核评估工作。因此提高疟原虫的实验室诊断水平是消除疟疾达标工作的重点之一，特别是县级疟疾诊断实验室对疟疾的准确诊断成为达标工作的关键。为提高四川省县级网络疟疾诊断实验室的诊断能力，本文通过省级疟疾参比实验室疟疾诊断结果的对照，评价县级实验室疟疾诊断能力，分析所存在的问题。

1　临床资料及方法

1.1　资料来源

收集2014年1月至2016年12月疟疾防治工作年报表和中国疾病预防控制信息系统(网络直报系统)数据，共获得四川省范围内980例疟疾患者资料，其中同时有血片和血样的共计有883例，另有35例同时缺乏血片和血样，31例有血样无血片，31例有血片无血样，不纳入本次研究。

1.2　样本来源

样本选取2014年1月至2016年12月四川省各县级疫情报送单位送检的253份疑似、230份临床、500份确诊疟疾病例的血片及血样。所有采集的样本均保证在采集后1周内送省级疟疾参比实验室进行复核，省级实验室在确认样品信息准确、样本质量合格后，签收保存。所有样本均按要求妥善运输、保存(血片、血样分别于室温和—20℃保存)，以保证样本的可靠性。

1.3　省级疟疾参比实验室镜检法

采用显微镜检查复核四川省各县级疫情报送单位中疑似、临床、确诊为疟疾病例的血片。

1.4　省级疟疾实验室PCR检测法

血样采用巢氏PCR检测疟原虫。采用国家参比实验室推荐的，根据疟原SSU rRNA基因保守区设计的扩增疟原虫PCR引物(见表1)[7]。核酸提取试剂盒购自Qiagen公司的QIAamp DNA Mini kit(批号：No.51304)，PCR反应混合物购自美国普洛麦格公司，100bp DNAmarker购自上海赛百盛基因技术有限公司，检测仪器主要有PCR扩增仪(AB2720)、电泳仪(Bio-Rad)、凝胶成像系统(Bio-Rad)。

1.5　统计方法

所有数据采用SPSS 21软件进行处理，计算相应构成比和率。

表1　巢氏PCR检测疟原虫种类的引物及其扩增产物长度

2　结果

2.1　样本总体构成情况

本次研究分析共纳入样本完整的疟疾病例883份，其中以恶性疟原虫阳性与间日疟原虫阳性所占比例最高，卵形疟原虫感染病例、三日疟原虫感染病例与混合感染病例相对较少，见表2。

2.2　省级镜检与PCR复核结果对比

省级PCR检测与镜检复核结果完全一致的样本共计有766例，符合率达到86.75%(766/883)，其中阳性样本701例，包括间日疟原虫阳性284例，恶性疟原虫396例，三日疟原虫6例，卵形疟原虫7例，混合感染8例，见表3。

表2　疟疾复核样本结果构成比

表3　疟疾复核样本分型阳性符合率

2.3　县级镜检结果与省级复核结果比对

以省级PCR和镜检检测的一致结果为依据进行统计即共计766例，县级镜检中有701例样本与省级定性相符，定性阳性符合率为91.51%(701/766)，另有65名非疟疾患者被误诊。县级镜检分型与省级结果一致的共有606例，分别为260例间日疟原虫，340例恶性疟原虫，4例三日疟原虫，1例卵形疟原虫，1例混合感染，分型阳性符合率为79.11%，其中间日疟86.96%，恶性疟84.58%，卵形疟20.00%，三日疟80.00%，混合感染为50.00%。另有160例患者感染虫种鉴别错误。有53名患者县级镜检仅判定为疟原虫感染阳性，但不能确认其具体分型，经省级复核，确认其构成分别为间日疟11例，恶性疟36例，卵形疟2例，阴性4例(见表3)。

3　讨论

疟疾为疟原虫引起的经按蚊传播的一种寄生虫病，是世界上最常见和危害最严重的热带病之一。四川省输入性疟疾病例多，分布面广，全年均可发生，我省连续三年输入性病例数占全国前三位，提示全省各地均要密切关注输入性疟疾疫情，建立监测预警机制[8]。

许国君等报道，四川省2010年～ 2013年5月应收集疟疾血片623张，但只收集和复核了224张，收集率为35.96%。2010年、2011年、2012年和2013年1～5月的收集率分别为：16.1%、44.38%、27.52%和55.05%[2]。而2014年～2016年的疟疾血片的收集复核率为99.07%。2013年开始制定四川省疟疾参比实验室检测细则，并规范全省样本收集细则，近几年各地区对疟疾的重视程度有了明显加强，为疟疾预防工作奠定了扎实的基础，为今后疟疾的防治提供了宝贵资料。

根据2014年1月至2016年12月所选取的样本，县级与省级复核检测结果以及分型阳性符合率发现县级实验室存在误诊(65名误诊病例)、虫种判定不准确(160名虫种判定错误病例)和不能判定虫种(53名未分型病例)等问题，与国内报道类似[9]。其原因可能有：1、县级实验室检测队伍不稳定，人员流动性大，能力参差不齐，导致实验室工作质量不稳定；2、县级实验室技术管理不规范，血片制作质量差，给镜检造成干扰；3、部分地区多年无疟疾病例或输入性病例逐年减少，导致实验室诊断技术的缺失和降低；4、感染原虫种类的复杂化，混合感染的出现，导致县级实验室诊断的困难，如表2所示卵形疟及混合感染的阳性符合率分别为20.00%、50.00%；5、输入性病例的不规范用药，导致现在低密度原虫数量增多，增加镜检的难度。

在结果分析中发现县级镜检有53例未分型(不能定虫种或无法定虫种)，这未分型的病例中就有36例为恶性疟原虫，恶性疟原虫所导致的恶性疟是临床症状最为严重，感染率及致死率在各种疟原虫中均占首位，由此带来的疫情风险也较高。这种未分型存在的问题其结果直接影响病例治疗方案的确定，临床病例的救治。

临床上，显微镜镜检是作为确诊疟原虫的金标准。但是，由于越来越多的干扰因素存在，如混合感染的增加，低密度原虫病例的增多，传统的显微镜镜检对疟疾诊断，存在一定的假阴性，无法满足疟疾防治工作的要求。新的诊断技术如分子生物学方法、快速检测试剂条法等应运而生[10]，以巢式PCR为代表的分子生物学方法开始逐渐被应用于疟疾的实验室检测中[11-15]。本组病例的巢氏PCR法与显微镜镜检的符合率为86.75%，不符合样本主要集中在混合感染以及低密度原虫样本的判定，造成这种差异度的原因除了检出限的差异，还与病例样本的保存不当、样本血样采集时间的不规范、病人是否已服用药物也有一定关系。

县级实验室的诊断能力是四川省全省所有县(市、区)实现消除疟疾目标，顺利通过国家考核验收的重要技术保证。提高县级实验室的诊断能力，需要从制度、培训和质量控制等多方面采取措施。尽管已制定《四川省疟疾诊断实验室规范》来规范县级实验室管理，明确了检验技术标准，但仍需完善省、市、县级疟疾网络诊断实验室的建设，逐级复核的疟疾网络诊断机制，为质量控制提供保障；需进一步开展针对性强化培训，以赛代训等多种形式，提升检验人员镜检水平；严格落实工作制度，加大督导检查力度，加强质量控制管理。

1World Health Organization. Global fund concept note development-WHO policy brief 2014[R]. Geneva: 2003.

2许国君,李黎,郁涛,等. 四川省疟疾流行态势与消除疟疾进展[J]. 现代预防医学, 2007, 34(21): 4002-4044.

3许国君,李黎,郁涛,等. 四川省疟疾流行态势与消除疟疾进展[J]. 预防医学情报杂志, 2014, 30(09): 783-787.

4李黎,刘阳,许国君,等. 2012-2014年四川省疟疾疫情分析[J]. 中国血吸虫病防治杂志, 2016, 28(04): 397-400.

5吴先萍,许国君,康杨,等. 四川省输入性疟疾现况与特征[J]. 现代预防医学, 2009, 36(24): 4667-4669.

6李黎,刘阳,许国君,等. 四川省2015年输入性疟疾流行病学特征分析[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2017, 35(01):75-79.

7谭妍,李志峰,凌华,等. 2015 年重庆市 3 例输入性卵形疟原虫wallikeri亚种感染病例的实验室诊断[J]. 热带病与寄生虫学, 2016, 14.3: 141-144.

8李黎,许国君,郁涛,等. 2011年-2013年四川省输入性疟疾疫情与诊治情况分析[J]. 预防医学情报杂志, 2015, 31(6): 471-475.

9黄雨婷,卢丽丹,佘丹娅,等. 贵州省县级和省级疟疾诊断实验室检测结果比较分析[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2015, 33(4): 308-308.

10 江莉,王真瑜,张耀光,等. 3种疟疾检测方法的应用分析[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2017, 35(1): 53-58.

11 武松,黄芳,张国庆,等. 巢氏PCR判定西藏疟疾流行区传疟媒介[J]. 中国人兽共患病学报, 2010, 26(07): 648-650+653.

12 周瑞敏,刘颖,钱丹,等. 2012年河南省疟疾标本的实验室检测分析[J]. 中国病原生物学杂志, 2014, 9(02): 177-179.