M3R激动剂通过激活PI3K/AKT信号途径促进肺癌细胞A549的上皮间质转化*

邢　静，林耿鹏，罗海丹，曾智敏，杨惠玲，郭禹标△

(中山大学 1附属第一医院呼吸内科，2中山医学院病理生理教研室，广东 广州 510080)

肺癌是当今全球范围内最常见的肿瘤之一[1]。在中国，肺癌是发病率最高的肿瘤，也是肿瘤死亡的最首要原因[2]。肺癌起病隐匿，超过半数的病人在就诊时已属晚期，肿瘤已发生远处转移丧失手术机会[3]。远处转移是肺癌进展的重要特征之一，了解肺癌远处转移的机制对于治疗肺癌有重要意义。国内外及本课题组前期实验均证实毒蕈碱胆碱受体3(muscarinic receptor 3，M3R)的激活能促进肺癌的进展[4-6]。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在肿瘤的迁移和侵袭过程中起重要作用，但M3R的激活是否能诱导肺癌细胞EMT目前尚未见报道，因此本文应用M3R激动剂卡巴胆碱(carbachol)探讨激动M3R对肺癌细胞EMT的影响及其可能的信号通路。

材　料　和　方　法

1　细胞、材料和仪器

肺癌细胞 A549由本实验室前期保存。RPMI-1640培养基、胎牛血清、0.25%胰酶和青霉素/链霉素均购自Gibco；carbachol、M3R特异性抑制剂4-DAMP和抗β-actin抗体购自Sigma；抗E-钙黏蛋白(E-cadherin)抗体购自ABclonal；抗p-AKT、AKT和波形蛋白(vimentin)抗体及HRP标记的抗鼠抗体和HRP标记的抗兔抗体均购自CST；Matrigel胶购自BD；RNA提取试剂盒购自康为世纪公司；逆转录试剂盒购自TaKaRa；qPCR试剂购自广州往圣生物科技公司；引物购自广州英韦杰津公司。化学发光成像系统购自Bio-Rad; 全自动倒置显微镜购自Zeiss；PCR仪购自Bio-Rad。

2　方法

2.1A549细胞的培养和传代A549细胞用含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基混合液培养，置于37 ℃、5% CO2培养箱中。采用0.25%胰酶溶液进行消化传代，取生长状况良好的对数生长期细胞用于实验。

2.2细胞形态的观察400 μmol/L carbachol处理细胞72 h,于全自动显微镜下观察未处理和处理后的细胞形态学变化。

2.3细胞划痕实验将肺癌A549细胞接种于6孔板，对照组不进行任何处理，carbachol组加入400 μmol/L carbachol，用200 μL的枪头在细胞板上划痕，37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养24 h，倒置显微镜下拍照，划痕愈合率(%)=(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。

2.4Transwell侵袭实验细胞分组处理同划痕实验。将肺癌A549细胞重悬于无血清培养基中，使用孔径8.0 μm的24孔Transwell小室，取6×105细胞200 μL加入上室，下室加入500 μL完全培养液，分组处理后置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养24 h,多聚甲醛固定，0.05%结晶紫染色，光学显微镜下随机选取5个视野，拍照并记录穿膜细胞数。

2.5qPCR检测A549细胞vimentin 和E-cadherin的mRNA表达实验分为3组：对照组不做任何处理；carbachol组给予400 μmol/L carbachol处理细胞72 h; carbachol+4-DAMP组同时给予400 μmol/L carbachol和50 μmol/L 4-DAMP处理细胞72 h弃去培养基，按照RNA提取试剂盒说明书步骤提取A549细胞的RNA，根据逆转录试剂盒说明书把提取的RNA逆转录为cDNA，应用qPCR检测vimentin和E-cadherin的mRNA表达情况，以GAPDH为内参照。引物序列见表1[7]。

表1　引物序列Table 1.Primer sequences for qPCR

2.6Western blot检测A549细胞p-ATK、vimentin和E-cadherin的蛋白水平细胞处理同qPCR实验。取A549细胞弃去培养基，用预冷的PBS清洗2遍后，加入含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的全细胞裂解液于冰上裂解10 min，使用细胞刮刮取蛋白，于4 ℃、12 000 r/min离心提取上清液。用BCA法测定蛋白浓度并配平。取蛋白进行SDS-PAGE，转膜至PVDF膜，5% BSA封闭后，加入 I 抗(β-actin稀释比例为1∶10 000；p-AKT、AKT、vimentin和E-cadherin稀释比例为1∶1 000)4 ℃孵育过夜，然后 II 抗室温孵育1 h，ECL法化学发光成像，ImageJ 3.0分析条带。

3　统计学处理

所有数据分析采用SPSS 20.0软件处理。计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，两组计量资料间采用独立样本t检验，多组计量资料比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Bonferroni校正的t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结　　果

1　卡巴胆碱对肺癌A549细胞上皮间质转化形态的影响

未处理的A549细胞为不规则多边形、细胞结合紧密，卡巴胆碱处理后A549细胞形态逐渐向梭形转化，细胞间结合松散。提示卡巴胆碱激活M3R可能会引起肺癌A549细胞上皮间质转化，见图1。

Figure 1.The effects of carbachol on the morphological changes of lung cancer A549 cells (×400).
图1卡巴胆碱对肺癌A549细胞形态的影响

2　卡巴胆碱能促进肺癌A549细胞迁移和侵袭

400 μmol/L卡巴胆碱处理24 h后发现，卡巴胆碱组划痕愈合率及穿膜细胞数量明显多于空白对照组(P<0.05)，见图2、3。

Figure 2.Carbachol promoted the migration ability of lung cancer A549 cells (×200).Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.
图2卡巴胆碱促进A549细胞迁移

Figure 3.Carbachol promoted the invasion ability of lung cancer A549 cells (×100).Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.
图3卡巴胆碱促进A549肺癌细胞侵袭能力

3　卡巴胆碱升高A549细胞vimentin表达水平并降低E-cadherin表达水平

qPCR及western blot结果显示，与空白对照组相比，经400 μmol/L卡巴胆碱处理72 h后，A549细胞的vimentin mRNA和蛋白表达量明显增加(P<0.05)，而E-cadherin的mRNA和蛋白表达量明显降低(P<0.05)；卡巴胆碱+ 4-DAMP组vimentin的mRNA和蛋白表达较卡巴胆碱组明显减少(P<0.05)，相反，E-cadherin的mRNA和蛋白表达量较卡巴胆碱组明显增加(P<0.05)。说明卡巴胆碱能促进vimentin的mRNA和蛋白表达并抑制E-cadherin的mRNA和蛋白表达，4-DAMP可以逆转卡巴胆碱的作用，见图4、5。

4　卡巴胆碱能够引起AKT磷酸化水平增加

Western blot结果显示，经400 μmol/L卡巴胆碱处理72 h后，A549细胞中磷酸化的AKT蛋白含量较空白对照组明显增加(P<0.05)，卡巴胆碱+ 4-DAMP组的磷酸化AKT蛋白表达较卡巴胆碱组明显减少(P<0.05)，卡巴胆碱+ 4-DAMP相对空白对照组的磷酸化AKT无明显变化,差异无统计学意义。说明卡巴胆碱能促进磷酸化AKT蛋白表达，4-DAMP可以抑制卡巴胆碱的作用，见图6。

Figure 4.The mRNA expression of vimentin and E-cadherin in human A549 cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vscarbachol group.
图4qPCR检测A549肺癌细胞vimentin和E-cadherinmRNA的变化

Figure 5.The protein expression of vimentin and E-cadherin in lung cancer A549 cells determined by Western blot.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vscarbachol group.
图5肺癌细胞A549vimentin和E-cadherin蛋白水平的变化

Figure 6.The protein level of p-AKT/AKT in the lung cancer A549 cells was determined by Western blot.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vscarbachol group.
图6肺癌细胞A549AKT磷酸化水平的变化

讨　　论

近些年来研究发现肿瘤能够自主合成并分泌乙酰胆碱，与胆碱能受体结合后构成“非神经源性胆碱能系统”。非神经源性胆碱能系统在刺激血管生成、上皮间质化转变和肿瘤促进中发挥重要作用[8]。 M3R是胆碱能受体家族中毒蕈碱胆碱受体的一员，已被证实在多种肿瘤中有高表达，并且与肺癌[5]、胃癌[6]和结肠癌[9]等多种肿瘤发生和进展密切相关。

转移是造成肿瘤疾病相关死亡的主要因素，现在认为EMT是上皮来源的恶性肿瘤细胞在肿瘤转移的关键事件[10]。EMT是指上皮细胞向具有间质细胞表型特征转化的生物学进程。在EMT过程中，上皮细胞原有结构改变，极性丧失，细胞间紧密连接的黏附力减弱，基底膜的破坏和细胞骨架的重建等变化使细胞的迁移和侵袭能力增强[11]。EMT最主要的分子特征表现为上皮细胞标记物表达降低，间质细胞标志物vimentin表达升高[12]。在本研究中，我们发现用M3R激动剂卡巴胆碱刺激A549细胞后，细胞形态向梭形转化，细胞迁移和侵袭能力增强，上皮细胞标记物E-cadherin表达降低而vimentin明显增高，表明这些A549细胞发生EMT，并出现EMT相关的转移。

PI3K/AKT是细胞内重要的信号通路之一，参与调控多种重要的生物学，且与多种肿瘤的发生进展密切相关[13]。PI3K能引起AKT磷酸化的激活，使磷酸化AKT的蛋白表达增加，进而调控下游的各种分子的活性[14]。在肿瘤进展过程中，PI3K/AKT通路的激活在肺癌[4]、乳腺癌[15]和胃癌[16]等多种肿瘤的EMT过程中发挥重要作用。磷酸化AKT可通过直接上调转录因子表达或间接促进金属蛋白酶表达等多种途径降低E-cadherin表达，引起EMT进程，使肿瘤细胞的侵袭能力增强[17]。本研究结果表明，M3R激动剂卡巴胆碱能够激活A549细胞的PI3K/AKT通路，使AKT磷酸化蛋白增加，促进A549细胞的EMT。

综上所述，激动M3R可通过激活PI3K/AKT信号通路促进A549细胞的EMT。但是否还存在另外的信号通路与PI3K/AKT信号通路协同或交叉，或独立地促进A549的EMT进程，还需进一步实验探索。

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