干扰HDAC1通过调控STAT3信号通路影响皮肤鳞癌细胞凋亡*

贾淑青，方锐华，莫金雪

(1广州市第一人民医院南沙医院皮肤科，广东 广州 511457； 2广州市第一人民医院皮肤科，广东 广州 510180)

皮肤是人体最大的器官，能够保护机体免于物理损伤，皮肤经过长时间的紫外线和辐射等损伤后，皮肤组织细胞中的DNA等发生断裂，导致皮肤发生癌变[1]。皮肤鳞状细胞癌(简称鳞癌)是一种常见的皮肤恶性肿瘤，其发病率呈现逐年上升的趋势，具有发展快、易转移等特点。组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)1参与核小体结构的变化过程和相关基因的表达，与转录因子的转录有关，参与细胞凋亡过程。HDAC1在前列腺癌、肾细胞癌和卵巢癌等肿瘤组织中表达升高，能够促进肿瘤细胞的生长[2-6]。信号转导及转录激活因子3(signal transdu-cer and activator of transcription 3，STAT3)信号通路在细胞生长和凋亡过程中发挥调控作用，STAT3磷酸化后，STAT3信号通路激活，细胞凋亡受到抑制[7-9]。有研究表明，抑制STAT3信号通路能够促进肿瘤细胞的凋亡[10-13]。本研究以皮肤鳞癌细胞为研究对象，通过RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术探讨HDAC1对细胞凋亡的影响，以期为靶向HDAC1治疗皮肤鳞癌提供理论基础。

材　料　和　方　法

1　材料

HDAC1小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)和小干扰RNA阴性对照(siRNA negative control，siRNA NC)为广州医科大学实验室保存。Lipofectamine 2000转染试剂为Invitrogen产品；RT-PCR试剂盒为Thermo产品；BCA蛋白浓度检测试剂盒为碧云天生物技术研究所产品； 抗STAT3、p-STAT3和cleaved caspase-3单克隆抗体均为SAB产品；抗HDAC1多克隆抗体为Santa Cruz产品。HDAC1和GAPDH引物由TaKaRa合成。

2　方法

2.1细胞培养皮肤鳞癌细胞A431购自广州吉妮欧生物科技。用含有10%胎牛血清的DMEM细胞培养液，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。将保存于液氮罐中的细胞放于37 ℃条件下不停地摇动，使细胞在1 min内融化，加入细胞培养液，1 000 r/min离心5 min，将上层液吸除后，加入5 mL的细胞培养液，接种于培养瓶中继续培养。待细胞密度超过80%时，用0.25%的胰蛋白酶对细胞进行消化传代。

2.2细胞分组及转染A431细胞培养至对数期后，分别转染HDAC1 siRNA和siRNA NC，记为HDAC1 siRNA组和siRNA NC组，同时设置空白对照(control)组，control组细胞不进行细胞转染。分别取HDAC1 siRNA和siRNA NC各12.5 μL，分别与250 μL不含血清的DMEM培养基混合，室温环境下孵育5 min；取Lipofectamine 2000转染试剂与250 μL不含血清的DMEM培养基混合，在室温静置5 min；将稀释后的siRNA和稀释后的Lipofectamine 2000混合后，室温环境下静置20 min，后加入到细胞密度约为60%的A431细胞中，孵育6 h，更换细胞培养液继续培养48 h，用于后续实验研究。

2.3RT-PCR检测转染后细胞中HDAC1的mRNA表达分别取培养48 h后的各组细胞，加入1 mL Trizol，混匀后裂解5 min。加200 μL氯仿，剧烈振荡反应15 s后，静置5 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min。吸取500 μL上清液于EP管中，加入500 μL的异丙醇溶液，混合后，静置5 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min。用75%的乙醇洗涤RNA 2次后，室温条件下晾干。用DEPC水溶解后，保存于-80 ℃。HDAC1 的上游引物序列为5’-AACTGGGGACCTACGG-3’，下游引物序列为5’-ACTTGGCGTGTCCTT-3’；GAPDH的上游引物序列为5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3’，下游引物序列为5’-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3’。 PCR反应程序为：95 ℃ 5 min； 95 ℃ 20 s、60 ℃ 60 s、72 ℃ 30 s，40个循环。以GAPDH为内参照，分析HDAC1的表达水平，实验重复3次，取均值。

2.4Western blot检测转染后细胞中HDAC1的蛋白表达分别取培养48 h后的各组细胞，加入细胞裂解液，待细胞完全裂解后，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，吸取蛋白上清液，按照BCA蛋白定量检测试剂盒检测蛋白样品的浓度。将蛋白样品与等体积的上样缓冲液混合煮沸后进行凝胶电泳，使用10%的分离胶和5%的浓缩胶，90 V恒压电泳至溴酚蓝进入到分离胶的底部；100 V电压将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，用5%牛血清白蛋白在37 ℃封闭90 min。加入 I 抗 (1∶1 000倍稀释)，4 ℃杂交过夜；再加入II抗(1∶2 000倍稀释)，室温孵育90 min。显色后，用Quantity One对蛋白进行定量分析，内参照基因为GAPDH，实验重复3次，取均值。

2.5MTT法检测细胞活力取各组细胞以每孔3 000个细胞的密度接种到96孔细胞培养板中，培养48 h后，加入20 μL MTT溶液(5 g/L)，37 ℃孵育4 h。弃上清液，在细胞中加入二甲基亚砜150 μL，待细胞结晶物融化后，用酶标仪检测每孔波长490 nm处的吸光度(A)，实验重复3次，取均值。

2.6流式细胞术检测细胞凋亡取各组细胞培养48 h后，收集106个细胞，用200 μL结合缓冲液悬浮细胞，加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL 碘化丙啶(propidium iodide，PI)，于室温环境下，避光反应15 min，再加300 μL缓冲液，用流式细胞术检测细胞凋亡，实验重复3次，取均值。

2.7Western blot检测细胞中STAT3、p-STAT3和cleaved caspase-3的蛋白水平取各组细胞培养48 h后，按照2.4的方法提取细胞蛋白，并用Western blot检测STAT3、p-STAT3和cleaved caspase-3的蛋白水平，内参照为GAPDH，实验重复3次，取均值。

2.8抑制STAT3信号通路对细胞凋亡的影响HDAC1 siRNA组细胞用STAT3信号通路抑制剂AG490(40 μmol/L)处理后48 h(记为HDAC1 siRNA+AG490组)，MTT法检测细胞活力(步骤参照2.5)，流式细胞术检测细胞凋亡(步骤参照2.6)，Western blot检测STAT3、p-STAT3和cleaved caspase-3水平(步骤参照2.7)。

3　统计学处理

所得的实验数据均采用SPSS 22.0统计学软件分析，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较应用方差分析并用Bonferroni校正的t检验进行两两比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

结　　果

1　转染后细胞中HDAC1的表达

RT-PCR和Western blot结果显示，与control组比较，siRNA NC组中HDAC1的mRNA和蛋白表达水平均无显著差异；HDAC1 siRNA组细胞中 HDAC1 的mRNA和蛋白表达水平均明显降低(P<0.05)，说明HDAC1 siRNA能够有效抑制皮肤鳞癌细胞中HDAC1的mRNA和蛋白表达，见图1。

2　HDAC1对细胞活力的影响

MTT实验结果显示，与control组比较,HDAC1 siRNA组的细胞活力明显降低(P<0.05)，说明干扰HDAC1表达能抑制皮肤鳞癌细胞的活力，见图2。

3　HDAC1对细胞凋亡的影响

流式细胞术结果显示，与control组比较，HDAC1 siRNA组细胞凋亡率明显升高(P<0.05)，说明干扰HDAC1表达能促进皮肤鳞癌细胞凋亡，见图3。

Figure 1.The expression level of HDAC1 in transfected cells.A:the mRNA level of HDAC1; B:Western blot was used to determine the protein expression of HDAC1.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.
图1转染后细胞中HDAC1表达水平的变化

Figure 2.The effect of HDAC1 on the cell viability.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.
图2HDAC1对细胞活力的影响

4　HDAC1对细胞STAT3、p-STAT3和cleaved caspase-3水平的影响

Western blot结果显示，与control组比较HDAC1 siRNA组细胞中的STAT3水平无显著差异，p-STAT3水平明显降低(P<0.05)，cleaved caspase-3水平明显升高(P<0.05)，说明干扰HDAC1表达能够促进皮肤鳞癌细胞中cleaved caspase-3的蛋白水平，抑制p-STAT3的蛋白水平，见图4。

Figure 3.The effect of HDAC1 on the apoptosis.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.
图3HDAC1对细胞凋亡的影响

Figure 4.The effect of HDAC1 on the protein levels of STAT3,p-STAT3 and cleaved caspase-3 in the cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.
图4HDAC1对细胞中STAT3、p-STAT3和cleavedcaspase-3蛋白水平的影响

5　STAT3信号通路抑制剂对细胞活力的影响

如图5所示，与HDAC1 siRNA组比较，HDAC1 siRNA+AG490组的细胞活力明显降低(P<0.05)，说明STAT3信号通路抑制剂AG490能够协同HDAC1 siRNA抑制皮肤鳞癌细胞的活力，见图5。

Figure 5.The effect of STAT3 signaling pathway inhibitor AG490 on the cell viability.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsHDAC1 siRNA group.
图5STAT3信号通路抑制剂对细胞活力影响

6　STAT3信号通路抑制剂对细胞凋亡的影响

如图6所示，与HDAC1 siRNA组比较，HDAC1 siRNA+AG490组细胞凋亡率明显升高(P<0.05)，STAT3蛋白水平无显著差异，p-STAT3蛋白水平明显降低(P<0.05)，cleaved caspase-3蛋白水平明显升高(P<0.05)，说明STAT3信号通路抑制剂AG490能够协同HDAC1 siRNA促进皮肤鳞癌细胞凋亡。

讨　　论

HDAC1是第一个被发现的组蛋白去乙酰化酶，其编码的蛋白含有482个氨基酸，在非组蛋白和组蛋白的去乙酰过程化中发挥重要作用，能够调控基因的转录和表达[14]。有研究发现，HDAC1在肿瘤组织中过度表达[15]。朱鑫等[16]通过免疫组化和RT-PCR的方法检测了51例肾透明细胞癌标本和24例癌旁组织中HDAC1的阳性表达率依次为62%和37%，HDAC1的mRNA水平依次为0.35和0.10。钟丽颖等[17]研究表明，小干扰RNA靶向抑制HDAC1表达后，卵巢癌细胞的凋亡率增加，细胞生长减慢。研究表明，干扰HDAC1 siRNA表达后的大肠癌细胞SW480的细胞凋亡率高达31%[18]。之后的研究报道称，干扰HDAC1 siRNA表达能够抑制舌鳞癌、宫颈癌和胃癌等多种癌细胞的生长，促进癌细胞的凋亡[19-20]。本研究结果显示，干扰HDAC1 siRNA表达后的皮肤鳞癌细胞活力下降，细胞凋亡率增加，与之前的研究报道相符合，均说明干扰HDAC1表达能够促进癌细胞凋亡。

Caspase蛋白家族成员的活性位点上均含有一个半胱氨酸蛋白酶，能够特异性地切割某些蛋白质，参与细胞凋亡过程。Caspase-3级联反应激活后细胞凋亡发生[21]。Caspase-3是caspase蛋白家族成员之一，是凋亡的执行因子，caspase-3活化后生成cleaved caspase-3，标志着细胞凋亡进入不可逆的阶段。Caspase-3参与多种肿瘤相关基因和药物调控胃癌、肺癌和口腔癌等癌细胞生长的过程[22]。Ho 等[23]研究表明，小檗碱能够通过调控caspase-3的表达影响舌鳞状细胞癌细胞的凋亡。本研究结果显示，干扰HDAC1表达后的皮肤鳞癌细胞中cleaved caspase-3水平升高，这提示，干扰HDAC1表达可能通过提高cleaved caspase-3的水平促进皮肤鳞癌细胞凋亡。

STAT3信号通路参与细胞的生长和凋亡过程，与肿瘤、心血管等疾病的发生有关[24]。有研究表明，肿瘤组织中p-STAT3水平异常升高，细胞中STAT3信号通路异常激活[25]。AG490是STAT3信号通路是上游酪氨酸激酶JAK的抑制剂，能够抑制细胞内STAT3信号通路的激活[26]。用AG490作用于肿瘤细胞后，肿瘤细胞的生长受到抑制作用，细胞凋亡增加[27]。本研究结果显示，干扰HDAC1表达后皮肤鳞癌细胞中p-STAT3水平下降，而用AG490作用后细胞凋亡率升高更多，细胞活力下降更多。这提示，降低HDAC1表达可能通过调控STAT3信号通路影响皮肤鳞癌细胞凋亡。

Figure 6.The effect of STAT3 signaling pathway inhibitor on apoptosis.A:the results of flow cytometry for analyzing the cell apoptosis; B:the results of Western blot for determining the protein levels of p-STAT3,STAT3 and cleaved caspase-3.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsHDAC1 siRNA group.
图6STAT3信号通路抑制剂对细胞凋亡影响

HDAC1除了能够通过调控STAT3信号通路影响肿瘤细胞生长以外，还可以与DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase-1，DNMT-1)结合形成复合物，调控影响E2F反应性启动子的转录[28]。在T淋巴细胞恶性肿瘤中发现HDAC1能够与STAT3结合形成HDAC1-DNMT1-STAT3复合物，随后有关学者又在骨肉瘤细胞中同样发现该复合物的形成，并且该复合体还可以通过调控SHP-1酪氨酸磷酸酶(SHP-1 tyrosine phosphatase)与STAT结合区域SIE/GAS 的表观遗传性抑制细胞增殖[29-30]。HDAC1对肿瘤的作用机制十分复杂，对于HDAC1影响皮肤鳞癌细胞生长和凋亡的作用机制还需要后续进一步研究。

综上所述，降低HDAC1表达能够抑制皮肤鳞癌细胞活力，促进皮肤鳞癌细胞凋亡，其作用机制可能与STAT3信号通路有关。本研究为后续进一步探讨HDAC1在皮肤鳞癌中的作用奠定了基础，为靶向HDAC1治疗皮肤鳞癌提供了理论依据。本研究只在体外初步探讨了HDAC1在皮肤鳞癌中的作用，后续实验中会对HDAC1在癌症中的具体作用机制进行深入研究，并会对HDAC1调控STAT3信号通路影响癌细胞凋亡的机制做深入探讨。

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