蛇床子素通过抑制SIRT1的表达增强阿霉素对p53野生型前列腺癌细胞的凋亡诱导活性*

陈小弟，赵贤宝,　骆高健

(义乌市中心医院 1中医科，2肿瘤科，浙江 金华 322000)

前列腺癌在男性肿瘤中的全球发病率为第2位，严重威胁人类健康[1-2]。目前，虽然手术治疗是临床上最有效的治疗前列腺癌的方法，但是化疗在术后辅助治疗及中、晚期前列腺癌患者的治疗中仍有不可替代的地位[3-4]。然而，一些肿瘤细胞对化疗敏感性的降低是目前面临的重大问题，因此探寻一些辅助治疗手段提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性对提高肿瘤患者生存率具有十分重要的意义。

在治疗前列腺癌的化疗药物中，阿霉素(doxorubicin，DOX)在临床中使用广泛。阿霉素又称为多柔比星，是一种抗肿瘤抗生素，能作为一种细胞DNA损伤药物抑制肿瘤细胞DNA的合成和修复，从而诱导肿瘤细胞发生凋亡性死亡[5-6]。然而，一些前列腺癌细胞对阿霉素诱导的凋亡存在抵抗性[7]，因此采取一些新的辅助治疗手段减弱前列腺癌细胞对阿霉素诱导凋亡的抵抗性显得十分重要。

蛇床子素是从中药蛇床子中提取的活性物质，具有较强的药理活性，近年来的研究还发现蛇床子素还有一定的抗肿瘤活性[8-9]，然而其是否能增强阿霉素对前列腺癌的抗肿瘤活性至今仍很少见报道。沉默信息调节因子 1(silent information regulator 1，SIRT1)是细胞中的一种组蛋白去乙酰化酶。在肿瘤细胞中，SIRT1能通过对一些重要的转录因子，如p53、p73和Ku70等进行去乙酰化失活，从而使肿瘤细胞逃避DNA损伤药物如阿霉素诱导的凋亡信号[10-13]。因此，SIRT1是干预化疗药物抗肿瘤活性的一个潜在靶点。本研究的目的在于探讨蛇床子素对阿霉素治疗前列腺癌的辅助作用并研究其机制是否和SIRT1的抑制有关。

材　料　和　方　法

1　细胞培养

人前列腺癌细胞系LNCaP和PC3购于ATCC，培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37 ℃恒温培养箱中培养并通入5% CO2。

2　实验试剂

阿霉素、蛇床子素、MTT和凋亡检测试剂盒购于Sigma-Aldrich；RPMI-1640培养基购于Gibco；抗SIRT1、p53、乙酰化p53、Puma、caspase-9、caspase-3、细胞色素C和GAPDH抗体购于Cell Signaling；p53小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)购于Santa Cruz；ECL试剂盒购于Pierce；pcDNA3.1和Lipofectamine 2000购于Invitrogen；线粒体分离试剂盒购于江苏碧云天生物技术有限公司。

3　方法

3.1瞬时转染SIRT1的过表达采用重组质粒转染的方法，将人SIRT1基因的开放阅读框架序列经PCR扩增后以分子克隆的方法与pcDNA3.1连接后构建成SIRT1重组过表达质粒；p53的基因沉默采用siRNA瞬时转染的方法来实现；转染无关寡聚核苷酸的细胞作为对照。瞬时转染简要步骤如下：分别将2 mg/L SIRT1质粒、50 nmol/Lp53 siRNA和无关寡聚核苷酸用Lipofectamine 2000进行包裹后将其加入到无血清培养基进行混合；将贴壁的细胞置于该无血清培养基孵育6 h，之后弃去无血清培养基并加入新鲜的含10%胎牛血清的DMEM培养基培养24 h。

3.2细胞活力的检测转染后的LNCaP或PC3细胞按每孔5×103个接种在96孔板上孵育过夜，分为对照组、蛇床子素组、阿霉素组、阿霉素+蛇床子素组，阿霉素+蛇床子素+SIRT1质粒组和阿霉素+蛇床子素+p53 siRNA组。对照组为无关寡聚核苷酸转染的细胞不加药物培养48 h; 蛇床子素组为无关寡聚核苷酸转染的细胞加入蛇床子素培养48 h; 阿霉素组为无关寡聚核苷酸转染的细胞加入阿霉素培养48 h; 阿霉素+蛇床子素组为无关寡聚核苷酸转染的细胞加入阿霉素联合蛇床子素培养48 h; 阿霉素+蛇床子素+SIRT1质粒组为SIRT1过表达质粒(2 mg/L)转染的细胞加入阿霉素联合蛇床子素培养48 h; 阿霉素+蛇床子素+p53 siRNA组为p53 siRNA(50 nmol/mL)转染的细胞加入阿霉素联合蛇床子素培养48 h；上述各组中无关寡聚核苷酸浓度为50 nmol/L,蛇床子素浓度为50 μmol/L，DOX浓度为0.5 μmol/L。药物处理完毕后在培养孔中加入20 μL浓度为5 g/L 的MTT再培养4 h，小心吸去上清液，往孔中加入150 μL二甲基亚砜，充分震荡后在570 nm波长下用酶标仪检测吸光度(A)值。细胞活力结果用药物处理组与对照组的A值比值表示。

3.3Western blot实验转染后的LNCaP细胞按每孔2×106个接种在6孔板上孵育过夜，按3.2所述进行分组培养。为了测定LNCaP细胞线粒体中细胞色素C的释放，先用线粒体分离试剂盒按说明书步骤将线粒体分离出来，然后再收集细胞质检测其中的细胞色素C的蛋白水平。其它蛋白质直接用蛋白提取液提取LNCaP细胞中的总蛋白质进行检测。将蛋白质用10% SDS-PAGE进行分离，分离完毕后通过电转方法将蛋白质从分离胶上转到PVDF膜上，用抗SIRT1、p53、乙酰化p53、Puma、caspase-9、caspase-3、细胞色素C和GAPDH抗体孵育过夜，之后再用带辣根过氧化物酶的 II 抗孵育2 h，最终蛋白条带用ECL试剂盒显色发光。

3.4流式细胞术检测细胞凋亡转染后的LNCaP细胞按每孔2×106个接种在6孔板上孵育过夜，按3.2所述进行分组培养。按照凋亡试剂盒说明书步骤将碘化丙啶和Annexin-V加入细胞中孵育20 min，采用流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡，凋亡率用Annexin-V阳性细胞数占总细胞数的百分比表示。

4　统计学处理

所有实验重复3次，实验数据用均数±标准差(mean±SD)表示，并用SPSS 15.0统计分析软件进行处理。多组间均数的两两比较采用单因素方差分析统计检验方法，以P<0.05为差异有统计学显著性。

结　　果

1　蛇床子素下调LNCaP细胞中SIRT1的表达并提高其对阿霉素的敏感性

细胞活力检测实验结果显示，蛇床子素能显著提高阿霉素对LNCaP细胞的杀伤活性(P<0.05)，见图1A。Western blot实验结果显示，蛇床子素能明显抑制LNCaP细胞中SIRT1蛋白的表达水平(P<0.05)，提示蛇床子素发挥协同效应的机制和可能和SIRT1的下调有关，见图1B。转染SIRT1过表达质粒后，蛇床子素联合阿霉素对LNCaP细胞的杀伤活性明显降低(P<0.05)，表明蛇床子素可能通过下调LNCaP细胞中SIRT1的表达来提高其对阿霉素的敏感性，见图1A。

Figure 1.Osthole sensitized LNCaP cells to DOX by downregulating the expression of SIRT1.A:osthole increased the cytotoxicity of DOX to LNCaP cells,which can be inhibited by SIRT1 plasmid transfection; B:osthole treatment down-regulated the expression of SIRT1 in LNCaP cells.Mean±SD.n=3.&P<0.05vsDOX group；#P<0.05vsDOX+osthole group；*P<0.05vscontrol group.
图1蛇床子素下调LNCaP细胞中SIRT1的表达并提高其对阿霉素的敏感性

2　蛇床子素促进阿霉素对LNCaP细胞的杀伤活性依赖于p53的活化

Western blot实验结果显示，蛇床子素能明显增强阿霉素对LNCaP细胞p53蛋白的诱导，使p53蛋白过表达并发生明显的乙酰化修饰，然而转染SIRT1过表达质粒后，蛇床子素联合阿霉素诱导的LNCaP细胞p53的表达及乙酰化水平显著降低(P<0.05)，表明蛇床子素通过下调SIRT1的表达促进阿霉素对LNCaP细胞p53的活化，见图2A。当LNCaP细胞转染p53 siRNA后，蛇床子素联合阿霉素对LNCaP细胞的杀伤活性显著降低(P<0.05)，见图2B。另外，Western blot实验结果显示，蛇床子素虽然同样能抑制p53缺失型前列腺癌细胞系PC3细胞[14]中的SIRT1表达水平(P<0.05)，但蛇床子素却不能明显提高PC3细胞对阿霉素治疗的敏感性，见图2C、D。这些结果表明蛇床子素是通过SIRT1/p53途径提高阿霉素对前列腺癌细胞杀伤活性的。

3　蛇床子素增强阿霉素诱导的LNCaP细胞发生线粒体途径的凋亡

Western blot实验结果显示，蛇床子素联合阿霉素能显著诱导LNCaP细胞中p53下游蛋白Puma[15]的表达(P<0.05)；同时，蛇床子素联合阿霉素还可明显诱导细胞色素C从线粒体释放到细胞质中(P<0.05)，表明蛇床子素可能对阿霉素诱导的线粒体途径凋亡有促进作用，见图3A、B。进一步实验发现，蛇床子素联合阿霉素能显著诱导LNCaP细胞中caspase-9及其下游凋亡执行蛋白caspase-3的活化(P<0.05)，并最终诱导LNCaP细胞发生显著凋亡(P<0.05)，见图3C、D。另一方面，无论是SIRT1质粒或p53 siRNA均能明显抑制蛇床子素联合阿霉素诱导的上述凋亡分子表达及活化，这些结果证明了蛇床子素能通过SIRT1/p53途径促进阿霉素诱导前列腺癌细胞发生线粒体途径的凋亡。

Figure 2.Osthole promoted DOX-induced cell death in LNCaP cells through the SIRT1/p53 pathway.A:Osthole promoted DOX-induced expression and acetylation of p53 in LNCaP cells; B:knockdown ofp53 inhibited cell death of LNCaP induced by osthole and DOX co-treatment; C:osthole suppressed the expression of SIRT1 in PC3 cell line; D:osthole failed to enhance the cytotoxicity of DOX against PC3 cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group；&P<0.05vsDOX group；#P<0.05vsDOX+osthole group.
图2蛇床子素通过SIRT1/p53途径促进阿霉素对LNCaP细胞的杀伤活性

讨　　论

肿瘤(包括前列腺癌)对化疗药物的抵抗是临床上限制化疗疗效的重要因素[16-17]。有文献报道，联合一些中药活性成分进行辅助治疗是提高化疗药物抗肿瘤活性的有效策略[18]。近年来有研究报道了蛇床子素能明显增强肾上腺髓质嗜铬瘤和肺癌细胞对化疗的敏感性[19-20]，提示蛇床子素可能是一种很好的化疗增敏剂。然而，蛇床子素是否对前列腺癌的化疗有辅助治疗作用，至今还未充分报道。本研究发现蛇床子素能明显提高p53野生型前列腺癌细胞对阿霉素的敏感性。

SIRT1是一种组蛋白去乙酰化酶。文献报道SIRT1在乳腺癌、肝癌和前列腺癌等多种肿瘤中发生过表达，从而促进肿瘤的发生、生长、转移并诱导化疗药物抵抗的发生[21-23]。因此，SIRT1目前已成为肿瘤治疗和化疗药物增效的重要靶点。本研究发现SIRT1在前列腺癌中是蛇床子素的靶点，蛇床子素能通过抑制前列腺癌细胞中SIRT1的表达来增强阿霉素治疗对LNCaP细胞的杀伤活性。

在SIRT1的下游底物中，p53蛋白是重要的凋亡调控因子。正常情况下肿瘤细胞中的p53维持在较低水平。然而p53在DNA发生损伤(如用阿霉素进行治疗)时会发生乙酰化修饰，而乙酰化的p53能稳定存在并具有转录活性，能诱导下游Puma等促凋亡蛋白的表达而使细胞发生凋亡[24-26]。然而，肿瘤细胞中SIRT1的过表达能通过去乙酰化作用使p53蛋白无法在阿霉素的诱导下发生乙酰化激活，从而保护肿瘤细胞逃避药物诱导的凋亡信号。本研究发现蛇床子素能通过下调p53野生型前列腺癌细胞中SIRT1的表达水平，使p53恢复对阿霉素诱导的DNA损伤的敏感性而发生乙酰化修饰，而蛇床子素诱导的p53乙酰化又诱导下游促凋亡蛋白Puma的表达，从而使p53野生型前列腺癌细胞在阿霉素的治疗下发生线粒体途径的凋亡。本研究中，p53缺失型前列腺癌细胞对蛇床子素和阿霉素联合治疗不敏感也佐证了这一结论。

Figure 3.Osthole promoted DOX-induced mitochondrial apoptosis in the LNCaP cells.A:combination with osthole and DOX significantly induced the expression of Puma in the LNCaP cells; B:osthole promoted DOX-induced release of cytochrome C from mitochondria into cytoplasm in the LNCaP cells; C:osthole promoted DOX-induced cleavage of caspase-9 and caspase-3 in the LNCaP cells; D:combination with osthole and DOX significantly induced apoptosis of LNCaP cells,which was suppressed by either SIRT1 plasmid or p53 siRNA.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vsDOX group;#P<0.05vsDOX+osthole group.
图3蛇床子素增强阿霉素诱导的LNCaP细胞发生线粒体途径的凋亡

综上所述，本研究证明了蛇床子素能通过抑制STRT1表达显著提高阿霉素对p53野生型前列腺癌细胞的杀伤活性。

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