PD-L1在乳腺癌中的表达及其与细胞免疫的相关性分析

王立东，徐卫国，杨 鑫，李蕊洁，谌娜娜，郭红辉，赵跃鹏

(1.华北理工大学附属医院肿瘤外科，河北唐山063009；2.迁安市人民医院肿瘤放化疗科，河北迁安 064400；3.迁安市人民医院病理科，河北迁安 064400；4.承德县医院外科，河北承德 067400)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。研究证实，乳腺癌的生物学行为具有高淋巴管侵袭性，转移能力强，尽管经过规范的治疗,但仍然有相当部分乳腺癌患者出现复发转移。据统计，全球每年约52.2万人死于乳腺癌[1]。因此研究乳腺癌中与复发、转移相关，影响患者肿瘤微环境的异常信号通路，可能为乳腺癌的临床治疗提供新的靶点。本研究采用免疫组织化学法检测乳腺肿瘤组织中程序性死亡受体1(PD-L1)蛋白的表达情况，流式细胞术检测患者外周血清淋巴细胞亚群水平，探讨PD-L1蛋白与乳腺癌临床病理特征的相关性，并分析PD-L1蛋白表达水平与乳腺癌患者细胞免疫的相关性，旨在为乳腺癌的临床治疗提供新思路。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2010年9月至2016年9月于迁安市人民医院行手术治疗且临床资料完整的114例乳腺癌患者病理标本，均为女性患者，年龄为33～78岁，中位年龄51岁，组织学类型均为浸润性导管癌，术前均未行放疗、化疗或内分泌治疗。乳腺癌病理标本根据第7版国际抗癌联盟(UICC)乳腺癌TNM分期标准分期。根据术后免疫组织化学结果，雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)表达大于10%，即认为阳性；当人类表皮生长因子受体2(Her-2)为3+时认定为阳性，0～1+认定为阴性，2+时需结合FISH检测结果，如存在基因拷贝数扩增认定为阳性，反之则为阴性；选择Ki67阳性指数14%作为其表达水平高低的界定点，免疫组织化学结果显示Ki67≥14%判定为Ki67高表达，<14%认定为Ki67低表达[2]；组织学分级：应用Bloom-Richardson分级法将乳腺癌组织标本分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级。本研究通过该院伦理委员会审批。患者及家属均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1主要仪器和试剂 石蜡切片机购自德国Leica公司；倒置光学显微镜购自日本Nikon公司；病理标本微波处理仪购自意大利MILESTON公司，4 ℃冰箱购自美的冰箱厂，鼠抗人PD-L1单克隆抗体购自Proteintech公司；柠檬酸钠-EDTA抗原修复液、5%牛血清清蛋白(BSA)封闭液、二抗、链霉素亲和素-生物素-过氧化物酶(SABC)、二氨基联苯胺(DAB)显色剂、苏木素购自MDL公司。

1.2.2免疫组织化学方法 乳腺癌组织石蜡块连续切片，每片2.5 μm，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，3%双氧水室温下浸泡切片10 min，柠檬酸钠-EDTA抗原修复液抗原修复，自然冷却至室温，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后使用5%BSA封闭液封闭组织，一抗(鼠抗人PD-L1单克隆抗体1∶100)孵育4 ℃过夜。PBS清洗后孵育二抗37 ℃，30 min。滴加SABC试剂孵育30 min，DAB显色，苏木素-伊红(HE)复染，梯度乙醇脱水，树胶封片观察，随机观察5个高倍视野。

1.2.3染色结果评定 细胞质及细胞膜棕褐色为PD-L1阳性表现，染色结果按照每张切片阳性细胞比例及着色深浅计分，行半定量分析。根据每个视野阳性细胞率及着色强度进行分级计分，然后根据两项之积平均数判定其阳性强度。染色强度评分：无色判定为0分，淡黄色判定为1分，棕黄色判定为2分，棕褐色判定为3分；再按阳性细胞百分率评分；阳性细胞小于5%为0分，5%～25%为1分，>25%～50%为2分，>50%～75%为3分，>75%为4分。染色强度与阳性细胞百分比的乘积小于或等于1为阴性,大于1为阳性[3]。

1.3统计学处理 采用SPSS17.0统计软件进行统计分析。非正态分布计量资料用M(P25，P75)表示，组间比较采用秩和检验。单因素分析采用Fisher确切概率法。计数资料用频数表示，组间比较采用χ2检验，检验水准α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1免疫组织化学染色结果 实验结果显示，PD-L1阳性表达时，组织细胞膜和细胞质呈均匀染色状态，为棕褐色，见图1。在114例乳腺癌组织中，35例PD-L1蛋白阳性表达，阳性率为30.7%。

A:阴性表达 (HE×100)；B：阴性表达(HE×400)；C：阳性表达(HE×100)；D：阳性表达 (HE×400)。

图1乳腺癌组织中PD-L1的表达

2.2PD-L1表达与临床病理特征关系 PD-L1表达与肿瘤大小(T分期)、Ki-67表达水平、组织学分级相关(P<0.05)。与年龄、淋巴结状态、ER、PR、Her-2表达水平无相关性(P>0.05)。PD-L1主要表达于肿瘤较大、分级高、Ki-67高表达的患者，见表1。

2.3PD-L1阳性表达与PD-L1阴性表达患者淋巴细胞亚群计数的比较 经两独立样本的秩和检验，PD-L1阴性表达患者CD3+、CD3+CD4+、CD3-CD16+CD56+细胞的水平高于PD-L1阳性表达患者(Z=10.705、9.135、7.563；P=0.009、0.016、0.024)，差异有统计学意义,见表2。

表1 PD-L1 的表达与乳腺癌患者临床病理特征的关系(n)

表2 PD-L1阳性表达与PD-L1阴性表达患者淋巴细胞亚群计数的比较[M(P25，P75)]

3 讨 论

PD-1是CD28/CTLA-4共刺激受体家族中的一员，与其配体PD-L1相互作用向T细胞传递一个抑制信号从而在肿瘤部位产生免疫抑制的肿瘤微环境[4]。肿瘤细胞可异常上调 PD-1及PD-L1的表达，抑制 T 细胞的免疫活性，造成肿瘤免疫逃逸，导致肿瘤发生、发展[5]。PD-L1不仅表达于抗原提呈细胞(APC)和树突状细胞，也表达于活化的单核细胞和B细胞，不同器官的非淋巴组织[6]。研究表明，PD-L1 亦表达于人类多种肿瘤细胞表面，例如肺癌、肾癌、黑色素瘤、乳腺癌等，抑制T细胞的活化，诱导其凋亡，促进肿瘤进展[7]。

本研究纳入114例乳腺浸润性导管癌患者，免疫组织化学法检测乳腺癌组织中PD-L1蛋白表达情况，结果显示PD-L1表达于乳腺癌组织的细胞膜和细胞质中，染色均匀，着色明显，共35例PD-L1阳性表达，阳性率为30.7%。区燕华等[8]用免疫组织化学方法检测了154 例乳腺癌组织中PD-L1 的表达情况，结果显示其阳性表达率为22.7%，与本课题研究结果相近。耿卫朴[9]研究了40例乳腺浸润性导管癌中PD-L1的表达情况，发现PD-L1阳性表达率为45%，与本课题研究结果有一定差别。本研究采用Fisher确切概率法分析PD-L1与临床病理特征的相关性，结果显示PD-L1表达与肿瘤大小、组织学分级、Ki-67的表达情况相关(P<0.05)，与ER、PR、Her-2、淋巴结状态无明显关联性。PD-L1主要表达于肿瘤大于5 cm、Ki-67高表达及高组织学分级患者中，与QIN等[10]报道的结果相似，提示PD-L1的表达与更差的病理学特征相关。本研究采用独立样本秩和检验对PD-L1阳性表达组与PD-L1阴性表达组患者淋巴细胞亚群计数进行了比较，结果显示PD-L1阴性表达组患者CD3+、CD3+CD4+、CD3-CD16+CD56+细胞的水平高于PD-L1阳性表达组患者，两组CD3+CD8+、CD3-CD19+、CD4+/CD8+的细胞表达水平差异无统计学意义，而以上标记细胞亚群所代表的功能分别为：CD3+与人体T细胞免疫相关，其降低提示着机体免疫功能低下；CD3+CD4+和CD3+CD8+代表着辅助/诱导型T细胞和抑制/细胞毒性T细胞，其升高与降低与总T细胞相似；CD3-CD19+细胞水平的高低可反映机体细胞免疫的状态；CD3-CD16+CD56+细胞的水平则反映机体内NK细胞的活性，其可见于某些肿瘤细胞及病毒感染的细胞毒性作用；CD4+/CD8+比值的异常提示患者机体免疫功能处于失衡状态。本研究的结果提示，PD-L1的高表达可以恶化乳腺癌患者自身的细胞免疫，其机制可能与PD-L1相关通路抑制患者机体细胞免疫相关。

肿瘤的免疫治疗已然成为一种治疗肿瘤的重要方式。得益于癌细胞对常规治疗较敏感，使得部分乳腺癌患者的生存时间较其他恶性肿瘤患者更长，但复发转移性乳腺癌目前尚不可治愈，现有治疗手段终将会对这部分患者失效。这些肿瘤患者有可能在现有治疗方法全部失败后再次获益于抗PD-1/PD-Ls治疗，使其生存期进一步延长。本研究采用免疫组织化学法，以乳腺癌组织中PD-L1蛋白的表达情况为切入点，探讨PD-L1蛋白与乳腺癌临床病理特征的相关性，并分析PD-L1 蛋白表达水平与乳腺癌患者细胞免疫的相关性，结果显示PD-L1的表达与乳腺癌更差的临床病理特征密切相关，PD-L1的表达可以提示患者细胞免疫功能的下降。

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[8]区燕华,林骏,罗深秋.程序性死亡因子配体1 在乳腺癌中的表达及意义[J].广东医学,2015,36(10):1515-1517.

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