Map3k1基因下调对B6小鼠眼睑角质形成细胞增殖和迁移能力的影响*

景 瑾，刘莉莉，尤 杰，夏婷婷，张 进，刘 春，朱顺星△

(1.南通大学杏林学院，江苏南通 226001；2.南通大学实验动物中心，江苏南通 226001)

研究表明眼睑发育异常主要是由于眼睑角质形成细胞迁移受阻所致[1]。大量资料显示，Map3k1基因在小鼠眼睑形态建成过程中起到关键作用。Map3k1是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中的重要成员，其表达的蛋白细胞外信号调节激酶1(MEKK1)具有广泛的生物学功能。MEKK1蛋白是MAPK信号传导通路的结点，可以调节JNK[2]、ERK1/2[3]、P38[4]、IKK-NFκB[5]等信号通路，这些信号通路参与调控相关细胞的增殖、分化、凋亡、迁移和侵袭等[2-5]，对细胞的生存、生长起着至关重要的作用。本研究拟采用RNA干扰技术，实现对Map3k1的特异性沉默，来检测其对B6小鼠眼睑角质形成细胞生物学功能的影响。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 B6(C57BL/6，B6)小鼠购自南通大学实验动物中心，饲养在清洁级屏障动物房内， 室内温度为(23±2)℃， 湿度控制为(55±5)%，自由采食和饮水，室内照明采用12 h∶12 h 明暗交替，定期更换笼具、垫料。

1.1.2主要仪器及试剂 CO2细胞培养箱购自Thermo公司(美国)；倒置相差显微镜购自Leica公司(德国)；抗菌药物、大豆胰蛋白酶抑制剂购自Amresco公司(美国)；角质形成细胞无血清培养基(DK-SFM)、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)购自Gibco公司(美国)；中性蛋白酶Ⅱ购自Roche公司(瑞士)；24孔细胞培养板购自Corning公司(美国)；质粒抽提试剂盒购自Omega公司(美国)；Mouse monoclonal to MEKK1购自Abcam公司(英国)；Anti-Mouse IgG、HRP-linked Antibody购自Cell Signaling公司(美国)。

1.2方法

1.2.1B6小鼠眼睑角质形成细胞的分离和原代培养 取1 d B6小鼠，超净台中取眼睑，在75%乙醇中清洗，然后在0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)中清洗；将眼睑放入添加有中性蛋白酶Ⅱ(3 mg/mL)和抗菌药物的DK-SFM 培养液中，4 ℃消化18 h；加入等体积的PBS，分离真皮和表皮，将表皮充分剪碎，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA，37 ℃消化约10 min；再加入大豆胰蛋白酶抑制剂终止消化，1 200 r/min 室温离心5 min，弃上清液，PBS清洗一遍，加入含有10 ng/mL表皮生长因子(EGF)的DK-SFM 培养液重悬细胞；调整细胞密度为2×105个/mL；将细胞接种于12孔板，37 ℃、5% CO2培养箱中培养；24 h后更换培养液，每隔1 d换液1次。

1.2.2靶向沉默Map3k1基因的amiRNA表达载体 本课题组在前期实验中已成功构建靶向沉默Map3k1基因的amiRNA表达载体，并筛选出干扰效率最高的质粒[6]。Map3k1基因序列的miRNA靶向序列如下，miRNA3-F:5′-TGC TGA TCC ATC TCC TTT AAT AGG GAG TTT TGG CCA CTG ACT GAC TCC CTA TTA GGA GAT GGA T-3′;miRNA3-R:5′-CCT GAT CCA TCT CCT AAT AGG GAG TCA GTC AGT GGC CAA AAC TCC CTA TTA AAG GAG ATG GAT C-3。

1.2.3菌种复性与质粒抽提 -80 ℃冰箱中取出之前所保存的菌种，冰上溶解；吸取50 μL于1 mL LB液体培养基(含Amp+)中，37 ℃、220 r/min培养1 h；菌种状态良好时，直接以划线法涂LB平板[含氨苄青霉素(Amp+)]，倒扣平板，37 ℃培养过夜；用10 μL枪头挑取平板上单克隆菌落至5 mL LB液体培养基(含Amp+)中，37 ℃、220 r/min摇床培养过夜，1 mL保种，1 mL送上海生工生物工程股份有限公司进行测序；测序正确的再次摇菌，按试剂盒说明书提取质粒，获得的质粒，核酸蛋白定量仪测浓度，-20 ℃存储备用；分装部分抽提的质粒DNA，送上海生工生物工程股份有限公司进行测序分析。

1.2.4Map3k1 amiRNA-3质粒转染B6小鼠眼睑角质形成细胞 取2 μL Map3k1 amiRNA-3质粒(568 ng/μL)溶于100 μL Opti-MEM基培中，取2 μL Lipofectamin 2000溶于100 μL Opti-MEM基培中，分别轻轻混匀，室温各孵育5 min；将两个混合液轻轻混匀，室温孵育20 min；角质形成细胞换液，更换DK-SFM 培养液800 μL；混合液加入12孔板中，轻轻混匀，细胞于37 ℃，5% CO2培养箱中培养6 h后更换DK-SFM 培养液。细胞转染后24、48、72 h分别提取总RNA和总蛋白。

1.2.5Real-Time PCR检测Map3k1 mRNA相对表达量 根据实验时间点要求提取细胞总RNA，采用TRIzol法提取。使用逆转录试剂盒RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Roche公司)进行逆转录反应。根据Map3k1基因mRNA设计RT-PCR反应引物如下，GAPDH-F:5′-GGA GCG AGA CCC CAC TAA C-3′,GAPDH-R:5′-GGC GGA GAT GAT GAC CCT-3′;Map3k1-F:5′-GGT CCT AAG AGG TCA GCA GTA TG-3′,Map3k1-R:5′- GGA CAG GTG TGA CGG GAT G-3′。RT-PCR反应采用SYBR Green MiX试剂，反应体系如下：SYBR Green mix 10 μL、 Primer-F(10 pmol)0.5 μL 、Primer-R(10 pmol)0.5 μL 、cDNA 1 μL、ddH2O 8 μL。RT-PCR反应条件为：95 ℃，5 min；45个循环(95 ℃，15 s；60 ℃，20 s；72 ℃，30 s)，每个循环在延伸阶段收集荧光；产物熔解曲线分析：95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，15 s。各组细胞目的基因均以内参基因GAPDH进行校正，为了减少误差，实验重复3批样本，每个样本均重复3次，使用2-ΔΔCT法进行相对定量分析。

1.2.6Western blot检测Map3k1蛋白相对表达量 根据实验时间点要求提取各组细胞总蛋白；并取适量以BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度；按说明书配制分离胶及浓缩胶：Gapdh配制12%的分离胶，Map3k1配制6%的分离胶；常规程序电泳，直至目的蛋白充分跑开；电泳结束后，Gapdh以300 mA，60 min的条件转膜，Map3k1以110 V，120 min的条件转膜；转膜结束后将膜取出，置于封闭液中室温封闭2 h；在膜上滴加适量1∶1 000稀释的一抗，4 ℃孵育过夜；用TBST洗涤1次，TBS洗涤2次；加二抗室温孵育2 h；再用TBST洗涤1次，TBS洗涤2次，取1 mL ECL显色液显色1 min。

1.2.7四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测B6小鼠眼睑角质形成细胞的增殖水平 取对数生长期细胞，胰酶消化后离心收集，加入DK-SFM 培养液重悬细胞，细胞计数调整为 2×104/mL。将制备好的细胞悬液边轻轻混匀边加入96 孔板，每孔加入 100 μL；将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养过夜，第2天做转染，分为Ctrl Map3k1组与Map3k1 amiRNA-3组，Ctrl Map3k1组只加入培养基不加细胞，每组设5个复孔取均值，实验重复 3 次。在转染24、48、72 h后MTT法测细胞活力；不同时间Map3k1 amiRNA-3组及Ctrl Map3k1组每孔加入10 μL MTT 溶液，继续培养 4 h；再加入 100 μL Formanzan溶解液，培养箱继续孵育约4 h，显微镜下观察待结晶物充分溶解后，在酶标仪吸光度(A)570 nm处测量各孔的A值。

1.2.8划痕实验检测B6小鼠眼睑角质形成细胞的迁移能力 取对数生长期细胞接种到24孔板，每孔接种1×106个细胞，并设3个重复；Map3k1 amiRNA-3组与Ctrl Map3k1组于转染36 h后，弃原培养液，加入含有10 μg/mL 丝裂霉素C的DK-SFM培养液培养12 h；然后用100 μL的枪头在每个孔的中央进行十字划痕；吸去培养液，0.01 mol/L PBS 轻洗；加入含有10 ng/mL EGF的DK-SFM 培养液，于十字划痕处显微镜观察拍照，记为0 h，每孔照数个不同的位置；培养24 h 后，依据记录的大致位置再次拍照。

2 结 果

2.1Map3k1 amiRNA-3干扰质粒 测序结果与预期完全吻合(图1)，miRNA序列正确插入pcDNA-miRNA载体中。

2.2Map3k1 amiRNA-3质粒对Map3k1基因的干扰效率 Real-time PCR结果(图2A)表明在转染Map3k1 amiR-3质粒后48 h，B6小鼠眼睑角质形成细胞Map3k1基因mRNA的表达量下降最为显著，干扰效率高达70%(P<0.01)；Western blot结果(图2B、C)表明在转染Map3k1 amiR-3质粒后72 h，B6小鼠眼睑角质形成细胞Map3k1基因蛋白的表达量下降最为显著，干扰效率高达70%(P<0.05)。

A:Real-Time PCR检测Map3k1 mRNA相对表达量；B：Western blot检测Map3k1 amiRNA-3蛋白的相对表达量；C：Map3k1 amiRNA-3蛋白的相对表达量；a：P<0.05，b：P<0.01

图2 Real-Time PCR、Western blot检测Map3k1 amiRNA-3的干扰效率

2.3MTT法检测B6小鼠眼睑角质形成细胞的增殖水平 细胞增殖水平检测结果显示：Map3k1 amiRNA-3组在转染24、48、72 h细胞增殖水平显著低于Ctrl amiRNA组(P<0.05)。见表1、图3。

表1 MTT法不同时间细胞增殖水平检测

a：P<0.05，b：P<0.01，与Ctrl amiRNA组比较

2.4划痕实验检测B6小鼠眼睑角质形成细胞的迁移能力 Map3k1 amiRNA-3组角质形成细胞，在划痕后24 h，其穿过划痕区的细胞数量与相对距离均明显低于转染空载体的Ctrl amiRNA组(图4)，定量分析发现Ctrl amiRNA组迁移的细胞数为(615±39)个，Map3k1 amiRNA-3组仅有(325±34)个，差异有统计学意义(P<0.05)；细胞迁移划痕区的相对距离，Ctrl amiRNA组为(0.339±0.015)，MAp3k1 amiRNA-3组为(0.181±0.027)，两组差异有统计学意义(P<0.05)。

图4 划痕实验检测B6小鼠眼睑角质形成细胞的迁移能力

3 讨 论

眼睑是眼球前的软组织，当眼受到外界各种刺激时，可通过中枢神经的指挥及时将其关闭，从而阻挡外来异物或强光对眼睛造成伤害，对眼的发育和保护具有重要作用。若眼睑发育异常便会受到各种眼部疾病的困扰，如角膜病、白内障、视力减退等。研究表明眼睑发育异常主要是由于眼睑角质形成细胞迁移受阻所致[1]。有研究发现通过MEKK1的转导，可以引发角质形成细胞的迁移，MEKK1对角质形成细胞的运动有着至关重要的作用[7]。

RNA干扰是由双链RNA(dsRNA)诱发同源mRNA高效且特异性降解的现象，可以特异性剔除或关闭目的基因的表达，该技术具有成本低廉、高效率、高特异性、操作方便等优势[8-10]，已成为各大实验室探索基因功能的常用技术。

Map3k1基因位于5q11.2，其编码的蛋白称为MEKK1，全长196×103。MEKK1是MAPK家族中的重要成员，具有Ser/Thr激酶活性，其C-端为催化结构域，N-端为调节结构域，可以磷酸化与其结合的下游靶蛋白，从而介导蛋白间的相互作用并影响其行为和生物学功能。MEKK1蛋白是MAPK信号传导通路的结点，可以调节JNK[2]、ERK1/2[3]、P38[4]、IKK-NFκB[5]等信号通路，这些信号通路参与调控相关细胞的增殖、分化、凋亡、迁移和侵袭等[2-5]。Map3k1对细胞的发生、发展起着至关重要的作用，有研究表明Map3k1具有可决定细胞命运的开关样功能，即促进和抑制细胞凋亡的双重作用[11]。而MEKK1 作为几个 MAPK 通路的上游调节因子，亦涉及不同种类和细胞类型的生物学反应，包括角质形成细胞的分化、T细胞活化和压力刺激诱导的细胞凋亡等。因而，本研究拟采用RNA干扰技术，实现对Map3k1的特异性沉默，来检测其对B6小鼠眼睑角质形成细胞生物学功能的影响。期许为更好的理解、掌握Map3k1在B6小鼠眼睑角质形成细胞中的作用，及其在眼睑发育过程中的作用提供理论依据。

首先通过前期实验中已成功构建靶向沉默Map3k1基因的amiRNA表达载体[6]，实现对Map3k1的特异性沉默，干扰效率高达70%，为研究B6小鼠眼睑角质形成细胞生物学效应在干扰Map3k1前后的变化奠定了基础。

Map3k1基因参与调节各种类型的细胞运动迁移，研究发现Map3k1基因敲除的新生鼠由于上皮细胞迁移缺陷，导致出生时眼睑不能闭合[12]，说明Map3k1基因在小鼠眼睑形态建成过程中起到关键作用。Map3k1表达的缺乏可减少细胞的迁移和侵袭能力[13]。在本实验中发现靶向抑制Map3k1的表达后，B6小鼠眼睑角质形成细胞的迁移能力被显著抑制，无论是迁移的距离还是迁移的细胞数量都显著下调(P<0.05)。此外，还发现Map3k1的表达被抑制后，会影响B6小鼠眼睑角质形成细胞的增殖能力(P<0.05)。这些结果表明靶向抑制Map3k1的表达能够广泛的影响B6小鼠眼睑角质形成细胞的生物学行为，从而影响眼睑的发育。

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