MAGE-A9在结直肠癌中的表达及临床意义*

陈建平，陈 茜，施秀英，关 茜，孔 俊，张 曙，朱慧君，王旭东△

(1.南通大学附属医院检验科，江苏南通 226001；2.南通大学公共卫生学院医学检验系，江苏南通 226019；3.南通大学附属医院病理科，江苏南通 226001)

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是一种全球最常见的消化道恶性肿瘤，是世界第3高发恶性肿瘤，其病死率居恶性肿瘤第4位[1]。在过去的几十年里，尽管各种检测方法、新型外科技术、辅助疗法及靶向生物疗法等技术迅猛发展使得CRC患者的5年生存率有所提高，但是CRC患者总体生存率仍然较低[2]。因此，深入研究CRC发生、发展的相关基因，寻找CRC早期诊断及治疗的有效生物靶点，不仅具有重要的研究价值，而且具有巨大的临床应用前景。黑色素瘤相关抗原家族(melanoma-associated antigen，MAGE)首先从黑色素瘤中发现，是一组肿瘤相关抗原[3]，目前已经发现了60多个成员。MAGE-A是MAGE的亚家族，MAGE-A基因在多种肿瘤异常表达[4]。MAGE-A9是新近被发现的MAGE-A家族的成员，研究发现其在黑色素瘤、喉癌、非小细胞肺癌、多发性骨髓瘤及肝癌中异常表达，并且与肿瘤的发生、发展密切相关[5-6]。但是，目前有关MAGE-A9在CRC组织中的表达及其临床意义的相关报道较少。本研究拟观察MAGE-A9在CRC组织及相邻癌旁组织中的表达变化，以及其与患者预后的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 以2006年1月至2008年12月在南通大学附属医院行手术治疗、临床资料完整且保留蜡块的203例CRC患者为研究对象，男130例，女73例；年龄45～83岁(中位年龄64.1岁)。所有CRC患者在手术前均未经相关抗肿瘤治疗，如放疗、化疗或手术前免疫治疗等，并排除死于术后并发症的患者。所有标本诊断标准、组织学类型和临床分期按照2003版WHO肿瘤组织学分类标准及美国癌症联合委员会和国际抗癌联盟分期系统分别进行病理分类及TNM分期[7-8]。每份组织标本由该院两名病理学医师进行病理诊断。本次研究所有患者均签署知情同意书，并经过该院人类研究伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1qRT-PCR测定 MAGE-A9 mRNA表达通过实时定量聚合酶链反应分析(qRT-PCR)进行测定。选取23例新鲜CRC及相应癌旁正常组织标本，TRIZOL(美国Life Techologies公司)提取RNA。按试剂盒说明书进行逆转录为cDNA，后进行PCR扩增。PCR反应条件如下：95 ℃预变性3 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，反应40个循环。以GAPDH作为内参，比较癌组织及癌旁组织MAGE-A9基因相对表达量。GAPDH引物如下：5′-CAA TGA CCC CTT CAT TGA CC-3′(上游引物)和5′-GAC AAG CTT CCC GTT CTC AG-3′(下游引物)，202 bp。MAGE-A9基因特异性引物如下：5′-CAC TGT ATG TCA TCT CTG-3′(上游引物)和5′-ACT ACT GTC ATT CAT TAA CT-3′(下游引物)，280 bp。试验重复3次，取平均值进行分析。

1.2.2免疫组织化学染色 本研究采用EnVision 二步法进行免疫组织化学染色分析，试剂盒选购于北京中杉金桥生物技术有限公司。严格按照操作说明书进行石蜡切片中MAGE-A9蛋白检测。MAGE-A9兔抗人单克隆抗体购自美国San Diego公司，生物素化山羊抗兔二抗和辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素(三抗)为试剂盒中的原液。显色液进行免疫组织化学显色，不定时在显微镜下观察显色程度；苏木素复染，梯度乙醇脱水后封片、拍照。阴性对照以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗。由该院病理科医师阅片，每张切片随机取5个400倍视野。按着色强度评分如下：细胞无着色得0分，细胞着浅黄色得1分，细胞着棕黄色得2分，细胞着棕褐色得3分。 按阳性细胞比例评分如下：阳性细胞百分比0%～10% 得1分，阳性细胞百分比大于10%～50% 得2分，阳性细胞百分比大于50%～80% 得3分，阳性细胞百分比大于80%～100% 得4分。将细胞着色强度和阳性细胞比例的乘积作为MAGE-A9着色分数结果进行判读：≥3判为高表达，<3判为低表达[9-10]。

2 结 果

2.1MAGE-A9 mRNA在癌组织及癌旁组织中的表达 MAGE-A9 mRNA在癌组织和癌旁组织中的相对表达水平分别是44.92±8.03 和 3.81±0.93(P<0.05)。MAGE-A9 mRNA在癌组织中的表达是癌旁组织中的11.8倍。

2.2MAGE-A9蛋白在癌组织及癌旁组织中的表达 免疫组织化学结果显示，MAGE-A9蛋白在癌组织和癌旁组织中的高表达率分别是83.25%(169/203)和15.76%(32/203)，差异有统计学意义(P<0.01)。MAGE-A9蛋白主要定位于CRC细胞的细胞质(图1)，个别CRC组织标本中MAGE-A9蛋白定位于间质细胞。

2.3MAGE-A9在CRC组织的表达与患者临床病理参数的关系 CRC组织中高表达的MAGE-A9与患者肿瘤分化程度、TNM分期、肿瘤浸润深度和淋巴结转移有关(P<0.05)，见表1，而与患者年龄、性别、肿瘤位置、组织学类型及术前CEA水平临床病理参数无关。另外，有5例病例存在远处转移。

A、B、C、D:CRC组织中MAGE-A9呈阳性表达；E、F:MAGE-A9在癌旁组织中呈阴性表达；红色箭头：MAGE-A9定位于细胞质；绿色箭头：MAGE-A9定位于间质细胞；A、C、E：×40；B、D、F：×400

图1 免疫组织化学法检测CRC组织和癌旁组织中MAGE-A9蛋白的表达表1 CRC组织中MAGE-A9表达与患者临床病理特征的关系[n(%)]

续表1 CRC组织中MAGE-A9表达与患者临床病理特征的关系[n(%)]

a：混合腺癌(管状、黏液状)10 例；黏液癌8例；印戒细胞癌2例；腺鳞癌1例

2.4MAGE-A9的表达与CRC患者预后的关系 基于单因素Cox回归分析，MAGE-A9表达是CRC患者不良预后的危险因子(P<0.01)，肿瘤部位、肿瘤分化、TNM分期、肿瘤浸润深度、淋巴结转移及术前CEA水平均是影响CRC患者预后的相关因素(P<0.01)，见表2。对上述影响患者预后的因素进一步进行多因素Cox风险比例函数模型分析。结果表明，MAGE-A9表达、肿瘤部位、肿瘤分化、TNM分期和术前CEA水平是影响CRC患者预后的主要因素，见表2。Kaplan-Meier 法生存曲线显示高表达MAGE-A9组CRC患者的生存时间明显低于低表达MAGE-A9组(P<0.01)。结肠肿瘤、低分化肿瘤、晚期TNM分期及术前高CEA水平患者的生存时间明显较短(P<0.01)，见图2。

图2 MAGE-A9蛋白不同表达患者的生存曲线图表2 单因素和多因素分析临床病理特征对5年生存预后的影响

项目单因素分析nP95%CI多因素分析HRP95%CIMAGE-A9表达<0.016.537～34.7769.005<0.013.766～21.536 高109 低94年龄(岁)0.7360.678～1.735 <6075 ≥60128性别0.1140.408～1.101 男130 女73位置<0.012.044～6.0992.6010.0041.369～4.942 结肠153 直肠50组织学类型0.3500.292～1.547 腺癌182 其他a21分化程度<0.010.195～0.5130.4170.0040.231～0.751 高、中分化169 低分化34TNM分期<0.011.594～3.1282.1110.0191.129～3.948 0～Ⅰ46 Ⅱ80 Ⅲ～Ⅳ77浸润深度<0.012.673～19.244 Tis+T17 T244 T3+4a152淋巴结转移<0.011.214～1.785 N0125 N1a38 N1b20 N1c,N2a,2b20术前CEA(ng/mL)<0.011.691～5.2102.5250.0021.392～4.580 >1527 ≤15121

续表2 单因素和多因素分析临床病理特征对5年生存预后的影响

a：混合腺癌(管状、黏液状)10 例；黏液癌8例；印戒细胞癌2例；腺鳞癌1例

3 讨 论

MAGE是从黑色素瘤细胞系中发现并分离出的肿瘤特异性抗原基因[3]。MAGE基因分为MAGE-Ⅰ和MAGE-Ⅱ两大亚组[3]。MAGE-A 为MAGE-I的成员之一。MAGE-A1～MAGE-A12是MAGE-A家族的几个亚型，其中MAGE-A1和MAGE-A3是科学家们研究较为透彻的两个亚型[4,7]。近年来研究发现MAGE-A9在肝癌、食管腺癌、喉鳞状细胞癌等人类多种肿瘤组织中存在异常表达，并且与恶性肿瘤的侵袭转移、不良预后密切相关[5-6]。有研究发现在某些肿瘤中MAGE-A9是进行个性化免疫疗法的潜在靶点[8-10]。

在本次研究中，本课题组运用qRT-PCR法及免疫组织化学法分别检测了MAGE-A9 mRNA和MAGE-A9蛋白在CRC肿瘤组织和相应癌旁组织中的表达差异。结果显示MAGE-A9 mRNA和蛋白在CRC患者肿瘤组织中的表达均明显高于癌旁组织。这些发现表明MAGE-A9在人类肿瘤中的多态性，预示MAGE-A9可能与肿瘤的发展和进程有关。

本研究比较分析了MAGE-A9表达与CRC患者临床病理参数及临床预后的关系。分析发现MAGE-A9高表达提示CRC患者肿瘤低分化、较晚的TNM分期或淋巴结转移。本次研究中只发现5例远处转移病例，由于样本量较少，因此没有评估MAGE-A9和远处转移的关系。这些结果表明MAGE-A9可能在CRC的发生、发展中起了重要作用。运用Cox比例风险回归模型进行单因素预后分析表明MAGE-A9表达、肿瘤部位、肿瘤分化、TNM分期、肿瘤浸润深度、淋巴结转移及术前CEA水平与CRC患者预后有关。多因素预后分析进一步表明MAGE-A9高表达、肿瘤位置、肿瘤分化、TNM分期和术前CEA水平都是影响CRC患者预后的主要独立因素。使用Kaplan-Meier法分析显示，MAGE-A9低表达组CRC患者比MAGE-A9高表达组5年生存率长。这意味着MAGE-A9高表达提示临床预后差，MAGE-A9的过表达是一个独立的预后不良的重要标志，并可能成为CRC治疗的一个参考指标。因此推断在结直肠癌患者中，MAGE-A9从肿瘤早期即开始表达增高，在一定程度上起着癌蛋白的作用，其高表达在肿瘤细胞的生存、增殖中发挥了重要作用。此外，MAGE-A9高表达可能会打破人体内微环境平衡，在促进肿瘤细胞的增殖和远处转移过程中起着重要的作用。其机制需要通过体外细胞实验研究进行深入探讨。

有研究报道在喉鳞状细胞癌MAGE-A9高表达于细胞质和间质细胞[11]。值得注意的是，本研究中发现在少数CRC病例中MAGE-A9表达于间质细胞。这种现象可能需要进一步扩大样本量深入研究MAGE-A9在间质细胞表达的意义和潜在机制。

综上所述，本次研究结果显示CRC组织中MAGE-A9高表达，并与患者预后差密切相关。MAGE-A9可能是CRC诊断、预测CRC患者预后的重要指标，同时可作为CRC的潜在靶点个性化指导治疗方案的选择。

[1]李道娟,李前,贺宇彤.结直肠癌流行病学趋势[J].肿瘤防治研究,2015,3(1):1-12.

[2]HUANG C W,TSAI H L,CHEN Y T,et al.The prognostic values of EGFR expression and KRAS mutation in patients with synchronous or metachronous metastatic colorectal cancer[J].BMC Cancer,2013,13(13):599.

[3]BARKER P A，SALEHI A． The MAGE proteins:emerging roles in cell cycle progression，apoptosis，and neurogenetic disease[J].Neurosci Res,2002,67(6):705-712．

[4]HAMAI A,MEMEO L,COLAROSSI C,et al.Expression of MAGE-A antigens is frequent in triple-negative breast cancers but does not correlate with that of basal-like markers[J].Ann Oncol,2011,22(4):986-987.

[5]ZHAI X,XU L,ZHANG S,et al.High expression levels of MAGE-A9 are correlated with unfavorable survival in lung adenocarcinoma[J].Oncotarget,2016,7(4):4871-4881.

[6]LIU S,SANG M,XU Y,et al.Expression of MAGE-A1,-A9,-A11 in laryngeal squamous cell carcinoma and their prognostic significance:a retrospective clinical study[J].Acta Otolaryngol,2016,136(5):506-513.

[7]VANTOMME V,DANTINNE C,AMRANI N,et al.Immunologic analysis of a phase Ⅰ/Ⅱ study of vaccination with MAGE-3 protein combined with the AS02B adjuvant in patients with MAGE-3-positive tumors[J].J Immunother,2004,27(2):124-135.

[8]XU Y,WANG C,ZHANG Y,et al.Overexpression of MAGE-A9 is predictive of poor prognosis in epithelial ovarian cancer[J].Sci Rep,2015,5(5):12104.

[9]GU X,FU M,GE Z，et al．High expression of MAGE-A9 correlates with unfavorable survival in hepatocellular carcinoma[J].Sci Rep,2014,15(4):6625.

[10]CORBIERE V,CHAPIRO J,STROOBANT V,et al.Antigen spreading contributes to MAGE vaccination-induced regression of melanoma metastases[J].Cancer Res,2011,71(4):1253-1262.

[11]HAN L,JIANG B,WU H,et al.Expression and prognostic value of MAGE-A9 in laryngeal squamous cell carcinoma[J].Int J Clin Exp Pathol,2014,7(10):6734-6742.