阿萨希毛孢子菌通过分泌铁载体在低铁限制性条件下生长

孙伟 邓娟 苏建荣

(首都医科大学附属北京友谊医院临检中心，北京 100050)

毛孢子菌病 (Trichosporosis)是由毛孢子菌感染引起的一种局部或系统播散性真菌病[1]。近年来，毛孢子菌病的发病率呈明显上升趋势，已成为除念珠菌外致人类播散性感染的第2大酵母样真菌感染[2]，这与各种原因造成的免疫功能低下患者增多有关，其中，阿萨希毛孢子菌 (Trichosporonasahii,T.asahii)是引起人类毛孢子菌病的最常见、最重要的致病菌[3]。

铁参与众多的生物代谢过程，是生命体必须的营养元素，其存在着还原型Fe2+和氧化型Fe3+两种可以可逆变化的化合态。铁载体是微生物在低铁的限制性条件的条件下诱导合成的低分子量化合物，对Fe3+有特异的高亲和力。绝大多数微生物都可以合成铁载体，其与微生物的毒力有关，因为从宿主体内吸收铁是病原菌生存与感染的必要步骤。

目前，铁离子的利用、铁载体的合成和转运，及其在与宿主相互作用中的相应机制研究主要集中于细菌和部分真菌 (白念珠菌、酿酒酵母菌和烟曲霉等)[4-7]。国内外尚未见关于阿萨希毛孢子菌的铁离子利用情况的报道。本研究主要探讨阿萨希毛孢子菌在铁限制条件下如何利用铁离子。

1 材料与方法

1.1 菌株

阿萨希毛孢子菌临床分离株，分离自尿路感染患者，已经过VITEK 2 COMPACT2和MALDI-TOF MS质谱仪鉴定至种，阿萨希毛孢子菌标准株CBS2479，所有菌株使用之前均于-80℃冻存。

1.2 主要试剂与仪器

络天青 (CAS)、溴化十六碳烷基三甲铵 (HTDMA)、去铁胺、BCS、FeCl3、无水哌嗪均购自Sigma公司；酵母浸出粉胨葡萄糖培养基 (Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，YPD)培养基 (1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖)、沙氏培养基、哥伦比亚血平板均购自Oxfoid公司；无菌培养皿及96孔板 (Costar)；酶标仪 (TECAN，Infinite200)；VITEK2 COMPACT及MALDI-TOF MS质谱仪 (法国生物梅里埃公司)。

1.3 阿萨希毛孢子菌在低铁限制性培养基中生长曲线的绘制

低铁限制性培养基的配制 将200 μmol/L的去铁胺加入预先配制的YPD培养基中，并加入500 μmol/L的BCS去除YPD培养基中的铜离子。

菌株的准备 将-80℃冻存的阿萨希毛孢子菌转种至新鲜配制的YPD培养基中，35℃培养。

生长曲线的绘制 参照预实验中阿萨希毛孢子菌CBS2479的实验条件，将复苏后的阿萨希毛孢子菌菌体用含有 (或不含有)200 μmol/L去铁胺的YPD培养基分别制备成600 nm处吸光度值为0.1的菌悬液，记为YPD+去铁胺组 (实验组)和YPD组 (生长对照组)，35℃，水平摇床 (100 r/min)振摇培养。每隔1 h分别从实验组和生长对照组取1 mL菌液并测定二者600 nm处的吸光度值，记录OD 600 nm数值。以时间 (h)为横坐标，以OD 600 nm为纵坐标，分别绘制实验组和生长对照组的生长曲线。

1.4 CAS溶液法检测铁载体的产生情况

CAS检测液的配制 取10 mmol/L HDTMA (十六烷基三甲基溴化铵，109.35 mg)溶液30 mL加入到500 mL洗净干燥的容量瓶中，加入适量去离子水稀释；将7.5 mL Fe3+溶液 (1 mmol/L FeCl3·6H2O，含10 mmol/L HCl)与37.5 mL 2 mmol/L CAS (铬天青，45.40 mg)溶液混合均匀，一边震荡一边缓慢加入容量瓶中；称取21.54 g无水哌嗪溶于水，小心加入31.25 mL 12MHCl (pH=5.6)，随后一起加入容量瓶中，加去离子水至500 mL，混合均匀即得CAS检测液，装入干净的聚乙烯瓶中，避光保存备用。

CAS溶液法检测铁载体的原理 CAS蓝色检测液是络天青、HTDMA和铁离子组成的一种复合物，呈蓝色。当铁离子从CAS溶液中解离出来时，CAS溶液由蓝色变为桔黄色，根据加入适量铁载体前后CAS溶液在630 nm处的吸光度值来确定铁载体的浓度。CAS检测法是一种高灵敏度的化学方法，它不依赖于铁载体的结构，而是基于铁载体对Fe3+的亲和力。

检测方法 本研究中通过向YPD培养基中加入200 μmol/L的去铁胺制备低铁限制培养基，与阿萨希毛孢子菌共培养，如果该菌可以分泌产生铁载体，则可以解离后续加入的CAS溶液中的铁离子，使CAS溶液由蓝色变为黄色，分别检测实验组和对照组630 nm的吸光度值来分析阿萨希毛孢子菌产生铁载体的情况。

1.5 统计学分析

应用SPSS 17.0统计软件对数据进行统计学处理。计量资料采用两独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 阿萨希毛孢子菌在低铁限制性培养基中的生长不受影响

生长对照组和实验组阿萨希毛孢子菌24 h内的生长曲线如图1所示，加入去铁胺后5 h，阿萨希毛孢子菌的生长曲线虽略低于生长对照组，但差异没有统计学意义 (P>0.05)，即低铁限制性条件并不影响阿萨希毛孢子菌的生长。

2.2 阿萨希毛孢子菌在低铁限制性条件下可以产生铁载体

实验组与对照组阿萨希毛孢子菌分别培养16 h后，取各组上清100 μL进行CAS溶液法检测。与空白对照组 (CAS溶液+YPD培养基)、阴性对照组 (CAS溶液+YPD培养基+T.asahii)相比，实验组 (CAS溶液+YPD培养基+T.asahii+去铁胺)阿萨希毛孢子菌产生的铁载体高于其他两组，且差异具有统计学意义 (P<0.05)，试验重复3次，见图2。

3 讨 论

阿萨希毛孢子菌是引起人类毛孢子菌病最主要的致病菌。由于毛孢子菌对很多常规抗真菌药物耐药，目前该病治疗困难，免疫受损患者感染后死亡率较高。有研究表明阿萨希毛孢子菌对两性霉素B存在耐药性，并且有研究使用棘白菌素类药物导致播散性毛孢子菌病的病例[8-9]。我们前期的研究显示，三唑类药物 (尤其是伏立康唑)对阿萨希毛孢子菌有较好的疗效，但在治疗过程中逐渐呈现对唑类耐药的趋势[6-7，10-11]。因此亟需新的疗法来治疗反复发作的和播散性的毛孢子菌病。

图1 低铁限制性环境对阿萨希毛孢子菌的生长曲线无显著影响 图2 CAS法检测T.asahii在铁离子限制条件下可以产生铁载体

Fig.1There was no significant influence of iron-restricted condition on the growth curve ofT.asahiiFig.2T.asahiicould secrete siderophore under iron-restricted condition

铁在宿主和微生物之间的竞争中发挥着重要的作用，其参与许多代谢过程，并且与微生物的侵袭和毒力密切相关。另外，铁在维持机体自稳和免疫功能的发挥中起到交叉调节的作用[4-5]。铁是参与众多生物代谢过程的必须元素，其存在还原型和氧化型两种可逆变化的化合态，在自然条件下主要以三价的氧化物或氢氧化物形式存在，溶解性和生物可利用度极低。微生物在低铁的限制性环境中可以合成和利用铁载体从环境吸收铁，这是它们适应生长代谢的需要而发展出来的一种主要的铁吸收机制[6]。绝大多数微生物都可以合成铁载体，目前，关于铁载体的研究主要集中于细菌和部分真菌 (白念珠菌、酿酒酵母菌、曲霉菌属真菌)[7,12-14]。本研究选取临床分离的阿萨希毛孢子菌在低铁条件下培养，检测其是否产生铁载体，为后续相关研究提供实验室依据。研究结果显示，阿萨希毛孢子菌在低铁限制条件下可以分泌铁载体，从而保证其在低铁环境中的生长不受影响。

由于铁载体对铁的螯合作用是病原微生物在铁限制条件下摄取铁离子的重要途径，因此通过阻断铁载体的产生或阻断铁载体与铁离子的结合 (比如使用铁载体配体)可以抑制病原微生物对铁的利用，从而达到抑制其生长和代谢的目的。这提示铁载体途径可能会是治疗阿萨希毛孢子菌感染的新途径，与传统抗真菌药物联合使用可望起到事半功倍的效果[7]。因此，后续研究我们将进一步探索阿萨希毛孢子菌通过铁载体摄取铁离子的具体机制，为治疗播散性毛孢子菌病提供新策略。

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