棘白菌素在念珠菌中的耐药性

侯欣 徐英春 赵玉沛

(1.中国医学科学院北京协和医院检验科侵袭性真菌病机制研究与精准诊断北京市重点实验室 中国医学科学院北京协和医学院研究生院，北京 100730；2.中国医学科学院北京协和医院基本外科，北京 100730)

侵袭性真菌病 (invasive fungal disease，IFD)严重威胁着患者的生命，其病死率高，临床治疗效果依赖于患者对抗真菌药物的应答反应[1]。但是，抗真菌药物种类非常有限，唑类药物通过抑制14-α-羊毛甾醇去甲基化酶使麦角固醇的生物合成减少，后者是细胞膜的重要组成成分；多烯类 (如两性霉素B)作为成孔分子与细胞膜上的麦角固醇结合；氟胞嘧啶阻碍嘧啶代谢和DNA合成；棘白菌素能够非竞争性地抑制1,3-β-D-葡聚糖合成酶，该酶为真菌特有酶，不存在于人类及其他哺乳动物体内，催化合成真菌细胞壁重要多糖成分——β-1,3-D-葡聚糖[2]。棘白菌素属侵袭性念珠菌病 (invasive candidiasis，IC)患者的一线用药，据报道在美国60%的念珠菌血症患者接受棘白菌素治疗[3]。随着棘白菌素使用量的增加，耐药念珠菌导致临床治疗失败不断升高，引起广泛关注。

1 念珠菌耐棘白菌素的流行病学

棘白菌素是脂肽分子，包括阿尼芬净、卡泊芬净和米卡芬净，能够与FKS基因编码的β-1,3-D-葡聚糖合成酶的催化亚基结合，经美国FDA批准用于治疗食道念珠菌病和念珠菌血症，并作为中性粒细胞减少症发热患者经验治疗和造血干细胞移植患者的预防用药[4]。2016年美国感染性疾病学会 (Infectious Diseases Society of America，IDSA)推荐中性粒细胞减少念珠菌血症患者初始治疗使用棘白菌素，对非中性粒细胞减少的非危重患者，静脉或口服氟康唑是可替代棘白菌素的初始治疗药物，对于感染唑类耐药念珠菌和危重患者仍推荐使用棘白菌素[5]。棘白菌素抗菌谱较广，对大多数念珠菌有效，体外有杀菌效应，对曲霉属则为抑菌活性，对隐球菌属、镰刀菌属、毛孢子菌属、接合菌属无效[6]。对于唑类耐药菌株，如克柔念珠菌、光滑念珠菌，以及念珠菌生物膜有效。其口服生物利用度低，均需静脉注射；组织分布好，但难以进入中枢神经系统和眼睛。与其他药物相互作用少，相关不良反应也较少[7]。

近年来，念珠菌对棘白菌素的耐药率不断升高，特别是光滑念珠菌，可能与棘白菌素的预防用药有关。多数棘白菌素耐药是长期治疗引起，但也有短期用药导致耐药的报道[8]。针对念珠菌血症的全球抗菌药物监测项目SENTRY研究结果显示，8.0%～9.3%的光滑念珠菌对棘白菌素耐药[9]。据美国一家医院报道，十年间 (2001～2010)光滑念珠菌对棘白菌素的耐药率从4.9%增至12.3%，且80%耐药菌感染临床治疗失败[10]。更重要的是光滑念珠菌天然对唑类药物的敏感性低，已出现多重耐药菌株，给临床治疗带来巨大挑战。我国大规模多中心侵袭性真菌监测网 (CHIF-NET)2010～2014年数据显示，光滑念珠菌对棘白菌素的耐药率低于1%[11]。CHIF-NET 2010～2012年数据显示，近平滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌对棘白菌素的敏感性高于99.5%[12]。李岷等[13]利用微量肉汤稀释法和琼脂稀释法检测棘白菌素对氟康唑耐药的念珠菌的体外敏感性，结果表明三种棘白菌素对氟康唑耐药的念珠菌均有较好的抗菌活性,提示该类药物可在临床上治疗氟康唑耐药的念珠菌感染。

2 念珠菌耐棘白菌素的检测方法和判定标准

棘白菌素耐药性检测包括微量肉汤稀释法、E-test、纸片扩散法、半自动化检测系统、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI-TOF MS)、分子方法检测FKS基因突变。

2.1 表型检测

美国临床实验室标准化委员会 (CLSI)和欧洲临床微生物及感染病学会 (EUCAST)均建立了标准的微量肉汤稀释法检测棘白菌素敏感性，这些方法已通过参考实验室证实其结果可靠。而且CLSI纸片法也可用于检测其敏感性。根据CLSI和EUCAST折点文件及最新文献报道[14]的流行病学折点 (ECV)对常见念珠菌棘白菌素药敏折点进行了汇总 (见表1)。由于实验室间卡泊芬净药敏结果差异较大，因此EUCAST未建立卡泊芬净的折点并且不建议使用卡泊芬净的MIC值进行临床评估。表中可见，近平滑念珠菌和季也蒙念珠菌的MIC明显高于其他念珠菌。

一些实验室在使用CLSI、E-test和Sensititre Yeast One进行药敏时发现20%的光滑念珠菌和1/3以上的克柔念珠菌对阿尼芬净敏感而对卡泊芬净不敏感[15-16]，可能与卡泊芬净体外检测的可变性有关。因此，EUCAST推荐阿尼芬净和米卡芬净作为卡泊芬净药敏的标志物。在一项多中心研究中，商品化显色微量肉汤稀释法Sensititre Yeast One表现出良好的实验室间结果一致性[16]。VITEK 2能够检测卡泊芬净的敏感性，但目前该系统不能区分光滑念珠菌中介和敏感，因为折点不包括在其药物浓度范围，所以限制了它的应用。

2.2 基因检测

FKS突变与棘白菌素耐药息息相关，因此可通过FKS基因测序检测棘白菌素的敏感性。由于不同菌种所用的FKS引物不同，因此需要准确鉴定菌种，且该方法价格昂贵。目前尚无商品化的试剂盒，需要具备一定的分子生物学专业知识并通过内部验证。

2.3 MALDI-TOF MS

目前，将念珠菌和曲霉菌暴露于一系列卡泊芬净浓度中孵育15 h，MALDI-TOF MS通过检测真菌蛋白质组的变化从而判断药物敏感性，而且与CLSI标准方法的一致率为94.1%[17]。将白念珠菌与0.03 μg/mL和32 μg/mL的卡泊芬净孵育3 h，利用MALDI-TOF真菌药敏试验检测模式快速检测敏感性[18]，结果与FKS1突变及参考方法一致。MALDI-TOF可能成为快速可靠检测棘白菌素敏感性的方法，需要扩大菌种和药物类型进行进一步研究。

表1 常见念珠菌对棘白菌素药物敏感性测定CLSI折点、EUCAST折点和流行病学折点比较

注：S.敏感，I.中介，R.耐药，WT.野生型，non-WT.非野生型；a.流行病学折点和纸片法折点根据最新文献整理[14]

3 念珠菌耐棘白菌素的机制

3.1 FKS突变

念珠菌对棘白菌素耐药的主要原因是编码1,3-β-D-葡聚糖合成酶的基因FKS1或FKS2发生突变，导致对该类药物的亲和力降低。白念珠菌的基因突变主要发生在FKS1的两个热点区 (hot spot regions，HS)氨基酸残基641至649 (HS1)和残基1345至1365 (HS2)之间[19]。近平滑念珠菌复合体和季也蒙念珠菌对棘白菌素的MIC较高，因为前者FKS1 HS1的第660个氨基酸残基由丙氨酸代替了脯氨酸，后者第633个氨基酸残基由蛋氨酸代替了亮氨酸和第634个丙氨酸代替了苏氨酸[20]。本文将已报道的天然棘白菌素敏感低的菌种与其固有FKS突变进行了总结 (见表2)。天然棘白菌素低敏感性对临床治疗的影响不明，虽然这些氨基酸的改变在一定程度上降低了葡聚糖合成酶对棘白菌素的敏感性，但也受治疗水平的影响，因此合适剂量的棘白菌素对近平滑念珠菌复合体引起的感染仍然有效，但与患者人群有关[21-22]。研究表明近平滑念珠菌葡聚糖合成酶活性比白念珠菌低10至50倍，或许与其高MIC值有关[20]。光滑念珠菌的基因突变则发生在FKS1或FKS2，其中FKS2突变的氨基酸残基在659至667 (HS1)和1374至1381 (HS2)之间[23]，FKS2氨基酸突变发生率高于FKS1[4，23]。光滑念珠菌FKS1或FKS2的无义突变也能引起明显耐药[23]。FKS突变是棘白菌素光滑念珠菌感染治疗失败的独立危险因素，而且在预测临床治疗效果上，尤其当使用卡泊芬净治疗时，FKS突变比高MIC更有优势[24]。

表2 天然棘白菌素低敏感性菌种FKS突变位点

3.2 药物耐受性

棘白菌素能够减少细胞壁重要成分β-1,3-D-葡聚糖的合成，导致显著的细胞压力从而诱导细胞多种适应性保护机制。体外小鼠药效动力学实验表明这些适应性应答使得一部分细胞能够持续耐受高浓度棘白菌素[30]。细胞壁压力感受器 (如Mtl2、Wsc1)促发压力适应通路，包括细胞壁完整性、蛋白激酶C (PKC)、钙调磷酸酶-Crz1、高渗性甘油 (HOG)。Hsp90也是重要的压力应答成分，通过钙调磷酸酶和效应器Crz1发挥作用。破坏Hsp90能够降低白念珠菌和光滑念珠菌的药物耐受性[31-32]。

另一个重要的促进药物耐受性的原因是细胞壁几丁质的合成增加。几丁质和葡聚糖是细胞壁主要的结构成分，且其生物合成是相互依赖的。几丁质的补偿性增长受PKC、钙调磷酸酶和HOG的调节。在动物实验中已证实细胞壁几丁质增加的突变株对棘白菌素耐药，细胞壁成分改变能够使细胞壁厚度发生变化并通过增强免疫识别引起显著的宿主应答。几丁质生物合成的增加与高药物浓度下的“矛盾生长”也有关[33-34]。在最近一项对卡泊芬净低敏感而对米卡芬净高敏感的光滑念珠菌研究中，药物存在时能够调节鞘脂类的生物合成，这与棘白菌素脂肪族尾与细胞膜鞘脂相互作用有关[35]。

药物耐受性通路不足以导致临床治疗失败，主要是使细胞在药物存在的情况下保持稳定，从而形成稳定的FKS突变而成为耐药菌，其潜在的遗传机制尚不明确，可能与DNA修复有关。已证实的白念珠菌和光滑念珠菌的基因组在唑类药物中具有可塑性，可能同样适应于棘白菌素。

3.3 生物膜

同细菌一样，真菌生物膜也是细胞嵌入大量多糖基质，念珠菌和曲霉菌的胞外生物膜基质主要由β葡聚糖组成，能够隔绝药物，降低药物在细胞膜上的浓度。通过化学或基因方法调节胞外葡聚糖的合成，能够提高细胞对抗真菌药物的敏感性。转录调节子Rlm和Smi1及调节葡聚糖合成的FKS基因均可导致耐药生物膜[36]。

4 结 语

棘白菌素耐药率在不断升高，特别是长期接受治疗的危重患者更易出现，限制了药物的选择，患者预后往往不佳，因此早期药敏检测十分重要。大型医院对于高危患者应进行药敏试验，过去几年药物敏感性检测方法已得到优化，商品化的检测方法有待于进一步完善，分子基因检测和MALDI-TOF是对常规检测很好的补充。合理有效的抗真菌药物管理能够减少不必要的药物使用，降低选择性压力导致的耐药，减缓耐药率的升高。

[1] Brown GD,Denning DW,Gow NA,et al.Hidden killers:human fungal infections[J].Sci Transl Med，2012,4(165):165rv113.

[2] Perlin DS.Mechanisms of echinocandin antifungal drug resistance[J].Ann N Y Acad Sci，2015,1354(1):1-11.

[3] Cleveland AA,Farley MM,Harrison LH,et al.Changes in incidence and antifungal drug resistance in candidemia:results from population-based laboratory surveillance in Atlanta and Baltimore,2008-2011[J].Clin Infect Dis，2012,55(10):1352-1361.

[4] Perlin DS.Current perspectives on echinocandin class drugs[J].Future Microbiol，2011,6(4):441-457.

[5] Pappas PG,Kauffman CA,Andes DR,et al.Clinical practice guideline for the management of candidiasis:2016 update by the Infectious Diseases Society of America[J].Clin Infect Dis，2016,62(4):e1-50.

[6] Barchiesi F,Spreghini E,Tomassetti S,et al.Comparison of the fungicidal activities of caspofungin and amphotericin B againstCandidaglabrata[J].Antimicrob Agents Chemother，2005,49(12):4989-4992.

[7] Pfaller MA,Boyken L,Hollis RJ,et al.Wild-type MIC distributions and epidemiological cutoff values for the echinocandins andCandidaspp[J].J Clin Microbiol，2010,48(1):52-56.

[8] Lewis JS,Wiederhold NP,Wickes BL,et al.Rapid emergence of echinocandin resistance inCandidaglabrataresulting in clinical and microbiologic failure[J].Antimicrob Agents Chemother，2013,57(9):4559-4561.

[9] Pfaller MA,Castanheira M,Lockhart SR,et al.Frequency of decreased susceptibility and resistance to echinocandins among fluconazole-resistant bloodstream isolates ofCandidaglabrata[J].J Clin Microbiol，2012,50(4):1199-1203.

[10] Alexander BD,Johnson MD,Pfeiffer CD,et al.Increasing echinocandin resistance inCandidaglabrata:clinical failure correlates with presence ofFKSmutations and elevated minimum inhibitory concentrations[J].Clin Infect Dis，2013,56(12):1724-1732.

[11] Hou X,Xiao M,Chen SC,et al.Molecular epidemiology and antifungal susceptibility ofCandidaglabratain China (August 2009 to July 2014):a multi-center study[J].Front Microbiol，2017,8:880.

[12] Xiao M,Fan X,Chen SC,et al.Antifungal susceptibilities ofCandidaglabrataspecies complex,Candidakrusei,Candidaparapsilosisspecies complex andCandidatropicaliscausing invasive candidiasis in China:3 year national surveillance[J].J Antimicrob Chemother，2015,70(3):802-810.

[13] 李岷，沈永年，吕桂霞,等.棘白菌素对氟康唑耐药的念珠菌体外药物敏感性的研究[J].中国真菌学杂志，2009,4(2):78-81.

[14] Pfaller MA,Diekema DJ,Andes D,et al.Clinical breakpoints for the echinocandins andCandidarevisited:integration of molecular,clinical,and microbiological data to arrive at species-specific interpretive criteria[J].Drug Resist Updat，2011,14(3):164-176.

[15] Arendrup MC,Pfaller MA,Danish Fungaemia Study G.Caspofungin Etest susceptibility testing ofCandidaspecies:risk of misclassification of susceptible isolates ofC.glabrataandC.kruseiwhen adopting the revised CLSI caspofungin breakpoints[J].Antimicrob Agents Chemother，2012,56(7):3965-3968.

[16] Eschenauer GA,Nguyen MH,Shoham S,et al.Real-world experience with echinocandin MICs againstCandidaspecies in a multicenter study of hospitals that routinely perform susceptibility testing of bloodstream isolates[J].Antimicrob Agents Chemother，2014,58(4):1897-1906.

[17] De Carolis E,Vella A,Florio AR,et al.Use of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for caspofungin susceptibility testing ofCandidaandAspergillusspecies[J].J Clin Microbiol，2012,50(7):2479-2483.

[18] Vella A,De Carolis E,Vaccaro L,et al.Rapid antifungal susceptibility testing by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry analysis[J].J Clin Microbiol，2013,51(9):2964-2969.

[19] Park S,Kelly R,Kahn JN,et al.Specific substitutions in the echinocandin target Fks1p account for reduced susceptibility of rare laboratory and clinicalCandidasp isolates[J].Antimicrob Agents Chemother，2005,49(8):3264-3273.

[20] Garcia-Effron G,Katiyar SK,Park S,et al.A naturally occurring proline-to-alanine amino acid change in Fks1p inCandidaparapsilosis,Candidaorthopsilosis,andCandidametapsilosisaccounts for reduced echinocandin susceptibility[J].Antimicrob Agents Chemother，2008,52(7):2305-2312.

[21] Kale-Pradhan PB,Morgan G,Wilhelm SM,et al.Comparative efficacy of echinocandins and nonechinocandins for the treatment ofCandidaparapsilosisinfections:a meta-analysis[J].Pharmacotherapy，2010,30(12):1207-1213.

[22] Ghannoum MA,Chen A,Buhari M,et al.Differentialinvitroactivity of anidulafungin,caspofungin and micafungin againstCandidaparapsilosisisolates recovered from a burn unit[J].Clin Microbiol Infect，2009,15(3):274-279.

[23] Garcia-Effron G,Lee S,Park S,et al.Effect ofCandidaglabrataFKS1 andFKS2 mutations on echinocandin sensitivity and kinetics of 1,3-beta-D-glucan synthase:implication for the existing susceptibility breakpoint[J].Antimicrob Agents Chemother，2009,53(9):3690-3699.

[24] Shields RK,Nguyen MH,Press EG,et al.The presence of anFKSmutation rather than MIC is an independent risk factor for failure of echinocandin therapy among patients with invasive candidiasis due toCandidaglabrata[J].Antimicrob Agents Chemother，2012,56(9):4862-4869.

[25] Perlin DS.Resistance to echinocandin-class antifungal drugs[J].Drug Resist Updat，2007,10(3):121-130.

[26] Katiyar S,Pfaller M,Edlind T.CandidaalbicansandCandidaglabrataclinical isolates exhibiting reduced echinocandin susceptibility[J].Antimicrob Agents Chemother，2006,50(8):2892-2894.

[27] Arendrup MC,Perlin DS.Echinocandin resistance:an emerging clinical problem[J].Curr Opin Infect Dis，2014,27(6):484-492.

[28] Walker LA,Gow NaR,Munro CA.Fungal echinocandin resistance[J].Fungal Genetics and Biology，2010,47(2):117-126.

[29] Johnson ME,Katiyar SK,Edlind TD.New Fks hot spot for acquired echinocandin resistance inSaccharomycescerevisiaeand its contribution to intrinsic resistance ofScedosporiumspecies[J].Antimicrob Agents Chemother，2011,55(8):3774-3781.

[30] Slater JL,Howard SJ,Sharp A,et al.Disseminated candidiasis caused byCandidaalbicanswith amino acid substitutions inFKS1 at position ser645 cannot be successfully treated with micafungin[J].Antimicrob Agents Chemother，2011,55(7):3075-3083.

[31] Singh SD,Robbins N,Zaas AK,et al.Hsp90 governs echinocandin resistance in the pathogenic yeastCandidaalbicansvia calcineurin[J].Plos Pathogens，2009,5(7):e1000532.

[32] Singh-Babak SD,Babak T,Diezmann S,et al.Global analysis of the evolution and mechanism of echinocandin resistance inCandidaglabrata[J].Plos Pathogens，2012,8(5).

[33] Lee KK,Maccallum DM,Jacobsen MD,et al.Elevated cell wall chitin inCandidaalbicansconfers echinocandin resistanceinvivo[J].Antimicrob Agents Chemother，2012,56(1):208-217.

[34] Stevens DA,Ichinomiya M,Koshi Y,et al.Escape ofCandidafrom caspofungin inhibition at concentrations above the MIC (paradoxical effect) accomplished by increased cell wall chitin;evidence for beta-1,6-glucan synthesis inhibition by caspofungin[J].Antimicrob Agents Chemother，2006,50(9):3160-3161.

[35] Healey KR,Katiyar SK,Castanheira M,et al.Candidaglabratamutants demonstrating paradoxical reduced caspofungin susceptibility but increased micafungin susceptibility[J].Antimicrob Agents Chemother，2011,55(8):3947-3949.

[36] Desai JV,Bruno VM,Ganguly S,et al.Regulatory role of glycerol inCandidaalbicansbiofilm formation[J].MBio，2013,4(2):e00637-00612.