荧光染色和乳酸酚棉兰染色在甲真菌感染检测中的应用比较

董兴军 吴立华 王尚武

(湖北省潜江市皮肤病医院检验科，潜江 433100)

直接镜检是浅部真菌形态学检查的基本方法，也是最简单、快速、实用的实验室诊断方法。尤其是甲真菌感染患者病情顽固，易传播和交叉感染，给患者带来很大心里压力，临床需要准确诊断，及时治疗。本实验用乳酸酚棉蓝染液法和荧光染色法[1]对同一患者的同一部位标本同时进行镜检，比较这两种方法的镜检阳性率。

1 材料和方法

1.1 标本来源

取自本院皮肤科门诊患者，拟诊为甲真菌感染者。其中男145例，女135例，共280例。取材部位：指甲152例，趾甲128例。

1.2 方法

取材 用75%酒精在皮损处消毒，取活动性边缘的甲屑，趾 (指)甲取病甲下或近端甲屑，同时采集2份标本放置2张玻片上送检。

乳酸酚棉蓝染色法 染液配制方法：石碳酸20 mL，乳酸20 mL，甘油40 mL，蒸馏水20 mL，稍加热溶解，然后加入棉蓝50 mg，混匀，过滤即可。将标本置于玻片上，滴加一滴染液，覆上盖玻片，轻压使标本平铺5 min后镜检。

真菌荧光染色液 由南京汉瑞生物科技有限公司提供。主要成份：氢氧化钾、水溶性荧光增白剂、纯化水。制片同上。

器材 奥林巴斯CX31普通光学显微镜，奥林巴斯CX23荧光显微镜。

镜检 固定由两位具有多年工作经验的检验师进行全片观察，以发现多个孢子或菌丝判定为阳性。

1.3 统计学处理

采用SPSS 18.0统计软件，两样本率比较采用χ2检验，组间率的两两比较采用分割χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

对280例患者，每例同时采集两份标本到两块玻片上，分别进行荧光染色法 (280份)及乳酸酚棉蓝染色法 (280份)直接镜检，以高倍镜下观察到菌丝或孢子判定为阳性。结果见表1。不同部位的菌丝在两种方法中的形态见图1～4。

乳酸酚棉蓝染色法直接镜检，趾甲部、指甲部阳性率比较，差异无统计学意义 (χ2=0.17，P>0.05)。荧光染色法直接镜检，趾甲部、指甲部阳性率比较，差异无统计学意义 (χ2=0.06，P>0.05)，其中趾甲部用两种方法镜检，阳性率比较有统计学意义 (χ2=15.52，P<0.05)；指甲部用两种方法镜检，阳性率比较有统计学意义 (χ2=13.12，P<0.05)。

3 讨 论

皮肤癣菌是常见的真菌感染性皮肤病，其基本形态分为菌丝和孢子两种，取样直接镜检见到一定数量的菌丝或孢子，即可确定有真菌感染存在[2]。张宏等[3]根据真菌结构和感染部位指出乳酸酚棉蓝染色法可用于浅部真菌的直接镜检，这种方法取材简单，操作方便。用乳酸酚棉蓝染色后直接镜检，镜下菌丝形态结构清楚易辨，背景干净、清晰，反差大，孢子染色后呈圆形或椭圆形,易于分辨[4]。

表1 不同部位两种方法镜检结果情况 (n，%)

图1趾甲标本：乳酸酚棉蓝染色，×40图2趾甲标本：荧光染色，×40图3指甲标本：乳酸酚棉蓝染色，×40图4指甲标本：荧光染色，×40

Fig.1Toenail specimens: lactophenol cotton blue stain,×40Fig.2Toenail specimens:fluorescent staining,×40Fig.3Nail specimens: lactophenol cotton blue stain,×40Fig.4Nail specimens: fluorescent staining,×40

但不能对角质细胞起溶解作用，角质层细胞和菌丝同时被染成淡蓝色，特别在菌丝或孢子较少时更不易看到，由于真菌生长环境的因素，菌丝染色很淡，仔细才能看见。荧光染色法通过特殊荧光素与组织中可能存在的真菌细胞壁中的几丁质发生特异性结合[5]，在紫外光的激发下，可使真菌显示荧光。在荧光显微镜特定的激发光波段下 (340～400 nm),菌丝或孢子发出明亮的蓝绿色荧光，在黑暗的背景下特别显影，根据典型的菌丝横隔和出芽结构，非常便于识别。有一些纤维素也能被荧光着色，但没有菌丝那样分枝的管状结构，容易区分。标本经过荧光染色后，孢子呈明亮的圆形、椭圆形，有的长出芽胞，对脂肪滴不产生标记，与脂肪滴易于鉴别[6]，荧光染液还有KOH成份，能对组织细胞起溶解作用，使组织透明化，提高镜检阳性率。两种方法镜检甲真菌结果显示，荧光染色法优于乳酸酚棉蓝染色法 (χ2=28.44，P<0.05)，正确选择取样部位和足够的标本量，耐心细致地观察全片，结合临床症状，就能够提高镜检工作效率和准确率，但真菌菌种的明确仍需依赖真菌培养及鉴定。

[1] 刘运德，楼永良，王跃，等. 微生物学检验[M].第2版，北京：人民卫生出版社，2003：360-363.

[2] 帅丽华，宋秋荷，孙晓红.两种浮载液真菌直接镜检效果比较[J].中国真菌学杂志,2008,3(6):343-346.

[3] 张宏，廖万清，郭宁如，等.真菌感染的实验室诊断.实用临床真菌病学[M].第1版.北京:人民军医出版社，2009:10-13.

[4] 黄霞云，刘晶杰.真菌染色新方法的探索[J].实用医技杂志,2006,13(11)：1862-1863.

[5] 张宏，吴绍熙.深部真菌病快速诊断的新实验方法[J].国外医学皮肤性病学分册,1995，21(1):12-14.

[6] 韩德忞, 刘原志,朱均昊，等.荧光染色法与KOH湿片法在真菌直接镜检中的应用比较[J].中国真菌学杂志,2016，11(4):240-243.