干细胞向耳蜗毛细胞分化的研究概况

李迪 吴欣阳 吴革平

[摘要] 内耳毛细胞作为感知和平衡声音的主要换能器，它的形成受损或缺失都会导致不同程度的听力障碍。在哺乳动物中，内耳毛细胞是一种终末分化的细胞，因此毛细胞的损伤或缺失是不可再生的，造成的听力障碍也是永久性的。目前，很多研究者希望通过体外培养干细胞诱导分化为毛细胞或者毛细胞样细胞（HCLs）的方式来治疗因毛细胞缺失引起的听力障碍。虽然干细胞是有前途的细胞治疗的来源，但目前很少研究能使干细胞诱导成有效的毛细胞；并且即使能诱导成毛细胞，但是成功移植并使其在正确的位置发挥正常的生理学功能也是目前面临的一项巨大挑战。在该综述中，总结干细胞向内耳毛细胞分化的研究现状。

[关键词] 感音神经性耳聋；内耳干细胞；胚胎干细胞；毛细胞

[中图分类号] R4 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2018）01（b）-0196-03

[Abstract] The inner hair cells， as a major transducer of perceiving and balancing voices， its defect or loss can lead to different degrees of dysaudia. In the mammals， the inner hair cell is a kind of terminal differentiation cell， therefore， the injury or loss of hair cells is non-renewable， and the dysaudia is permanent. Currently， many researchers hope to treat the dysaudia caused by the loss of hair cells by in vitro culture of stem cells. Even though the stem cells are the origin of promising cells， there are few studies that can make the stem cells become the effective hair cells， even if it can be induced into the hair cells， the successful transplantation and making them give play to the normal physiology function in an accurate site is a great challenge， and we summarize the research status of cell differentiation from stem cells to cochlea hair cells in this paper.

[Key words] Sensorineural deafness； Inner ear stem cells； Embryonic stem cell； Hair cells

感音神經性耳聋是听力障碍疾病的统称，主要由于先天或后天性的内耳、听觉神经及听觉中枢病变，使传入内耳的声波不能被接收所引起的一种听力障碍。人类耳蜗包含内外两种毛细胞， 外毛细胞对声信号起到协调作用，内毛细胞把外界传入内耳的声信号转换成电信号，听觉神经元把接收到的电信号进一步传入听觉通道，进而传入听觉中枢[1]。人类的内耳毛细胞是一种终末分化的细胞，因此毛细胞的损伤或缺失是不可再生的，造成的听力障碍也是永久性的[2]。研究发现，哺乳动物的内耳毛细胞（HC）或与其下游的蜗神经元的损伤或丢失是导致听力障碍的主要原因。

虽然目前临床对于感音神经性耳聋的治疗途径众多，主要有助听器、振动声桥、人工耳蜗植入等。但这些方法都有各自的局限性，不能从根本上解决耳聋问题。为了重塑听觉功能，研究者们把研究目标指向了生物治疗——体外再生毛细胞。干细胞是具有自我更新和多种分化潜能的一种多功能细胞，因此研究者们希望通过体外培养干细胞，诱导其分化为内耳毛细胞或内耳祖细胞，然后把内耳毛细胞重新植入耳聋患者耳蜗内并发挥典型的内耳毛细胞的生理学功能，从而达到治疗感音神经性耳聋目的[3]。

1 胚胎干细胞向毛细胞的分化

胚胎干细胞（ESC）是一种具有多种分化潜能的细胞，在适宜的条件下可以分化为几乎所有的细胞类型。因此，干细胞治疗成为目前研究的热点。在早期研究中，ESC是被接种在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）形成的滋养层上进行培养的，MEF滋养层可以供给ESC生长所需的营养，并使ESC细胞处于未分化状态[4]。但是这种培养方式过程复杂、培养难度系数较大。此外在2D培养环境中，ESC细胞会直接粘附在培养板上；因此，它们的生长方式被限制为以平坦形状生长，不利于模拟体内组织器官的生长发育所需要的微环境。

近年来，根据临床实际应用的需要Koehler KR等利用一种新的培养技术：3D悬浮培养方式，不需要MEF的一类培养基即MEF-free培养基，以Matrigel作为底物，利用一种磁性微球载体和磁悬浮技术使贴有细胞的磁性微球载体悬浮在培养液中，加入多种细胞因子来维持ESC的自我更新，使ESC呈三维立体形态生长[5]。这种培养方式突破了传统的利用培养皿、培养瓶或微孔板等2D细胞培养方式中的繁琐、耗时、细胞产量小等局限性。这种培养方式就像ESC细处在胚胎中一样，可以更好的模拟体内胚胎发育的微环境。但是MEF-free这种培养方式因为成本比较高而限制了其使用率。所以，现在培养ESC使用比较多的还是基于MEF的培养方式。

在ESC向毛细胞分化的过程中会经历几个比较典型的阶段。例如，在Koehler KR的3D培养方式中，取E3.5的胚泡期胚胎，培养在LIF-2i培养基中，Matrigel作为底物，在E6.5的时候形成明确的外胚层；此时加入骨形态生成蛋白4（BMP4）和转化生长因子β（TGFβ）的抑制剂SB-431542的条件下，开始沿着非神经外胚层方向分化，在E7.5的时候形成NNE；接下来加入BMP4的抑制剂LDN-193189抑制BMP4的活性，并在生长因子FGF的作用下形成前基板外胚层，PPE随后形成otic-epibranchialplacode domain（OEPD），OEPD在Wnt的参与调控下发育成具有含有内耳毛细胞和支持细胞的假复层上皮的耳囊泡，并产生具有毛细胞静纤毛束和毛囊的毛细胞[5]。并有研究表明，转录因子Emx2参与调控毛细胞的立体纤毛束取向[6]。经过电生理检测显示，这些由干细胞衍生来的毛细胞具有典型内耳毛细胞的生理学功能，并且与分化而来的感觉神经元形成专门的突触联系，为内耳器官的体外发育奠定了基础。

2 内耳干细胞向毛细胞的分化

2003年，Li等从成年小鼠椭圆囊感觉上皮中分离出了一类可以在体外自我更新并分化为毛细胞的细胞。他们将这类细胞命名为内耳干细胞。后来，研究人员也逐渐从耳蜗器大上皮脊小上皮脊前庭球囊和椭圆囊感觉上皮等不同组织中分离得到了内耳干细胞。

近年来的研究发现内耳干细胞在体外可以分化为多种类型的细胞。Li等将分离的内耳干细胞接种在多聚赖氨酸预处理过的培养皿中，在无血清的条件下贴壁培养，14 d之后检测细胞组分，发现有毛细胞标志性分子Myosin VIIA和Brn3c的表达，表明至少部分细胞已经成功分化为内耳毛細胞。随后，Li等利用Myosin VIIA，Brn3c和Espin等毛细胞的特异性标记物通过免疫荧光的方法进一步证明了分化的细胞中确实有毛细胞的存在。另外，Oshiima将内耳干细胞接种在聚赖氨酸处理过的培养皿中，用DMEM/F12培养基（含B27和N2）在体外培养诱导分化两周。之后也成功检测毛细胞的存在。还有研究证实，内耳干细胞所处的微环境以及与相邻细胞之间物质交换、信号传递等对于内耳干细胞诱导分化为成熟的内耳毛细胞是至关重要的。

虽然体外已经成功的实现由内耳干细胞向内耳毛细胞的分化，但不可忽略的是在其分化的相关过程中仍然具有很多局限性。例如内耳毛干细胞的数目是非常有限的；并且体外培养过程比较复杂、培养难度系数大；再者其向毛细胞诱导的效率非常低，即使有部分内耳干细胞分化产生毛细胞，但这些毛细胞是否具有典型毛细胞的特性和生理学功能还需要进一步的论证。

3 其他干细胞向内耳毛细胞的分化

有研究结果显示，间充质干细胞在体外可以有效的分化为耳蜗毛细胞。Atoh1在间充质干细胞向毛细胞的分化中起着重要的调控作用。当过表达Atoh1，并与螺旋神经细胞共培养的条件下，体外间充质干细胞成功分化为毛细胞[7]。另外，还有研究证明诱导多功能干细胞在合适的培养诱导条件下也可以完成向内耳毛细胞的分化。说明在体外内耳毛细胞再生的探索中，可供选择的干细胞种类还是比较多的。

4 诱导过程中毛细胞的检测

耳蜗发育最重要的一步是将感觉前体细胞分化为毛细胞。这一过程受到一系列的转录因子以及信号通路的调控，如阳性调节因子Atoh1[7]，负调控因子Hes1和Hes5[8]，细胞周期蛋白，细胞周期蛋白依赖激酶（CDK）抑制剂（CKI）等。细胞分化和退出细胞周期是发育过程中两个紧密协调的过程。研究表明，抑制细胞周期抑制剂CKIs活性可以有助于毛细胞和支持细胞的产生[9]；RRD251可以破坏细胞周期调控因子Rb和Raf-1之间的物理相互作用，阻断Rb磷酸化，使毛细胞不能正常跳出细胞周期，从而抑制内耳毛细胞再生[10]。因此，准确鉴定和调控内耳毛细胞发育过程中的关键因子有助于更准确掌握毛细胞的分化情况。Atoh1是毛细胞形成过程中不可缺少的一个“螺旋-环-螺旋”结构的转录因子[7]。在哺乳动物中Atoh1的表达成为检测干细胞向毛细胞分化过程中的一个重要标志[7]。没有表达Atoh1的前体细胞，后期不能诱导分化为毛细胞和支持细胞。在出生后早起，虽然Atoh1只在短暂的时期内表达，但是研究结果显示在耳蜗发育中Atoh1这种瞬时性的表达对耳蜗毛细胞的正常发育所必要的。研究显示，Atoh1在E15.5至E17.5的表达是新生成的毛细胞存活的关键因素。随后，毛细胞的成熟以及立体纤毛束的生成都离不开Atoh1的表达。以上研究表明在耳蜗发育中Atoh1是毛细胞正常分化、存活和成熟的必要条件。

在目前体外培养毛细胞的方法中，最终分化而来的细胞是否为毛细胞，是否具有典型毛细胞的生理活性，还需要进一步的检测，目前主要的检测方法有以下几种。

①基因检测。在体外干细胞向毛细胞的诱导中，诱导成功的毛细胞通常会检测到Myosin VIIA，Brn3c和Espin这些蛋白的表达。因此，可以通过提取mRNA方式，检测分子Myosin VIIA，Brn3c和Espin的mRNA表达水平，来作为一个判定是否为毛细胞的条件[11]。

②免疫荧光染色标记检测。在内耳干细胞向毛细胞的分化过程中，内耳干细胞一般经过7 d分化为内耳祖细胞，经过14 d形成毛细胞。这3个典型的发育阶段可以通过FM1-43特异性标记后经流式分选得到，提取这3个阶段细胞的RNA做基因表达谱检测之后，确定了这3个阶段的特异性marker：内耳毛干细胞marker（Gdf10+Ccdc121），内耳祖细胞marker（Tmprss9+Orm1），毛细胞marker（Chrna9+Espnl[12]。因此可以免疫荧光染色的检测可作为判定毛细胞的一个重要依据。

③膜片钳电生理功能检测。通过检测分化而来的毛细胞的全细胞膜电流，K离子电流等分析此毛细胞是否具有电生理功能。

④电子扫描显微镜形态检测。内耳干细胞表面没有静纤维束，未成熟的毛细胞表面没有静纤维束或有较短的排列不规整的静纤维束，而分化成熟的毛细胞表面有规则排列的静纤毛束。

5 挑战与展望

近年来，毛细胞的相关研究取得了巨大的突破。从细胞系的建立，到一套成熟的培养方式的建立，再到后来的毛细胞以及类毛细胞样细胞的成功诱导以及分化各阶段的检测手段的建立等，都是研究者们不断探索的成功。但是目前仍有许多挑战：①毛细胞诱导率问题。毛细胞诱导率还很低。②毛细胞生理功能问题。虽然已有多种体外毛细胞检测判定方式，但都比较片面，目前未公认的权威的判定方式来。③植入问题。即使现在有多种植入方式，如从圆窗、蜗轴、半规管、鼓阶等，但哪种植入方式是比较有效的还有待考究。④植入后存活率以及发挥生理功能等问题都是目前面临的困难与挑战。

基于现有的感音神经性耳聋的治疗研究，我们推测感音神经性耳聋的治疗需要基因治疗与药物治疗、基因修饰、干细胞治疗甚至是与电子耳蜗植入相结合才使得临床治疗感音神经性聋真正成为可能。

[参考文献]

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（收稿日期：2017-10-11）