基于内耳干细胞的毛细胞再生调控研究进展

周吟毅,陈摇田,杨雪寒,王晓涵,齐洁玉,柴人杰,2,3,4,5

(1. 东南大学生物电子学国家重点实验室,附属中大医院耳鼻咽喉头颈外科,生命科学与技术学院,生命健康高等研究院,江苏省生物医药高新技术研究重点实验室,江苏南京 210096;2. 南通大学神经再生协同创新中心,江苏南通 226001; 3. 四川省医学科学院·四川省人民医院耳鼻咽喉头颈外科,四川成都 610072;4. 中国科学院干细胞与再生医学研究中心,北京 100101;5. 首都医科大学北京市神经再生修复研究重点实验室,北京 100069)

1 内耳干细胞

新生小鼠耳蜗中感觉上皮中含有干细胞，这些干细胞能在体外进行自我更新，并分化成毛细胞。研究鉴定了内耳听觉上皮中的Lgr5、Axin2和Frizzled9阳性内耳干细胞。Lgr5是一种Wnt共受体，是包括肠道、肝脏和皮肤在内的多种组织中公认的祖细胞标记物[6]。耳蜗中，Lgr5表达于小鼠耳蜗部分支持细胞中，包括第三排Dieters细胞、内柱细胞、内指细胞以及内边界细胞[7]。小鼠耳蜗中Axin2是Wnt信号通路中的β-catenin负调节子，表达于鼓阶边缘细胞中[8]。Frizzled9也是Wnt受体之一，表达于内指细胞、内边界细胞和第三排Deiters细胞，被认为是Lgr5阳性内耳干细胞中的一个亚群。在受到损伤的内耳组织中，内耳干细胞都可以再生具有各种特定毛细胞标记物的毛细胞[9]。

2 毛细胞再生的信号调控

数十年来，许多调控内耳发育过程的重要作用基因被发现。Atoh1在毛细胞发育和分化中起正向调节作用。小鼠胚胎期缺乏Atoh1会诱发毛细胞和相关支持细胞的完全丧失。同时，多种信号通路，包括Wnt、Notch等已被发现通过控制各种转录因子的表达来参与调节内耳发育。

2.1 Wnt信号通路Wnt信号通路在细胞生长发育及其再生中起到至关重要的作用，主要包括Wnt/β-catenin、Wnt/PCP和Wnt/calcium信号通路。从低等到高等哺乳动物，Wnt信号通路表现出高度保守性。Wnt蛋白作为配体和细胞膜上的受体蛋白特异性结合，激发多个下游通道，向胞内传递信号。Wnt/β-catenin参与哺乳动物内耳早期的听泡和听基板的分化[10]，Wnt信号分子主要在蜗管中发挥作用，靶基因主要位于听泡背侧，调节细胞极性和耳蜗管的延伸。此外，在小鼠胚胎发育过程中限制Wnt表达也可以控制半规管的形成[11]，在耳蜗感觉前体和支持细胞中上调Wnt信号，可促进毛细胞分化[12]，Wnt信号通路的激活也可以阻止耳毒性药物引起的毛细胞坏死和脱落[13]。然而，只有少数增殖的Lgr5阳性细胞转分化成毛细胞[14]。这表明，尽管Wnt激活可以增加内耳祖细胞，但Wnt激活本身并不能大量再生新的毛细胞。

2.2 Notch信号通路Notch信号在脊椎和非脊椎动物中广泛存在并高度保守。Notch配体受体特异性结合以后，受体蛋白经蛋白酶水解释放出胞内段，移位至核中与CSL、MAML蛋白家族结合构成复合物，解除转录抑制，驱动下游Atoh1等转录表达。内耳发育过程中，Notch信号通路在支持细胞和毛细胞的分化方面不可或缺，如参与耳蜗感觉前体细胞等形成[15]。Wnt和Notch通路在毛细胞再生过程中以拮抗的方式进行遗传相互作用。Notch通路的抑制可以活化Wnt/β-catenin信号，促进支持细胞转分化为毛细胞样细胞[16]。然而，Notch抑制诱导的支持细胞分化为毛细胞，是以支持细胞减少为代价的[17～19]。支持细胞的缺失又会导致包括新分化的毛细胞的死亡[14]。因此，单纯的Notch抑制也是长期毛细胞再生的理想解决方案。先让支持细胞增殖，然后让增殖的支持细胞分化为毛细胞可能是促进有丝分裂毛细胞再生的最佳途径。

2.3 Atoh1信号碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子Atohl是内耳毛细胞分化所必需的关键因子,它通过作用于下游靶基因从而启动内耳毛细胞的分化。Atoh1的过表达导致耳蜗非感觉区毛细胞和支持细胞的形成[20]或异位毛细胞的形成[21]。Atoh1由Notch信号通路下游基因Hes1、Hes5介导，调控毛细胞和支持细胞产生。抑制Hes1、Hes5能促进Atoh1的表达，从而促进支持细胞分化为毛细胞。尽管有这些有希望的发现，但Atoh1在动物中的强制表达显示出毛细胞的再生效率和功能成熟度的巨大差异，并且再生效率随着年龄的增长而进一步降低[22]。因此单纯的Atoh1不足以再生具有生理功能的成熟的毛细胞，可能需要其它转录因子增强。

2.4 其他信号分子Fox蛋白家族是具有翼状螺旋的转录因子，与染色质结合参与其结构重组。FoxG1是家族中的成员，在哺乳动物、果蝇、线虫中高度同源，参与脑、内耳等多种组织的增殖分化，在早期神经发育、线粒体能量代谢和生物合成中具有重要的调节作用。FoxG1与多种细胞信号转导通路网络紧紧联系。FoxG1缺失会对多个信号通路的表达产生影响，主要表现为细胞分化能力的增强和增殖能力的抑制。FoxG1可以直接或间接地对Wnt/β-catenin信号通路活性进行抑制。内耳干细胞中敲除FoxG1后诱发其向毛细胞的转分化[23]。

Lin28是一种进化上保守的RNA结合蛋白，作为胚胎干细胞自我更新的调节因子高度表达[24]。研究证明，由Lin28B蛋白和let-7 miRNA组成的通路通过增强mTOR信号通路活性调节P5期小鼠耳蜗外植体中新毛细胞的产生，Lin28B促进新毛细胞产生，let-7 miRNAs抑制其产生，两者是抑制彼此表达的拮抗剂[25]。此外，LIN28B和卵泡抑素Follistatin共激活增强了新生小鼠的自发耳蜗毛细胞再生[26]。

Hippo信号通路参与内耳毛细胞损伤和自我修复过程。调控Hippo信号通路的关键蛋白Mst1/2可以促进Hippo信号通路效应因子YAP1的细胞核内转移，诱导毛细胞再生[27]。

3 多基因协同调控毛细胞再生

毛细胞再生的经典调控信号通路如Wnt、Notch、Atoh1、Hippo/Yap等信号之间存在丰富的通讯网络。如Wnt激活与Notch抑制的协同调控可以促进出生后小鼠耳蜗的毛细胞再生[28, 29]。而Notch 通路抑制与Hippo通路抑制协同作用促进毛细胞再生[27],特别是在促进支持细胞直接转化为毛细胞方面。在新生Lgr5阳性祖细胞中共同激活Wnt和Atoh1可以提高毛细胞生成的效率[30]；在Sox2阳性支持细胞中抑制Notch、激活Wnt和Atoh1，使得内耳的感觉和非感觉区域诱导了毛细胞的异位生成[29]。然而，这些新生成的毛细胞部分没有表达终末分化标志物(内毛细胞的vGlut3和外毛细胞的Prestin)，也没有显示成熟耳蜗毛细胞的形态学特性，这表明这些新的毛细胞仍然不成熟且无功能。

在耳蜗发育过程中，毛细胞的形成和成熟受到多种信号和转录因子的时空调控。Atohl作为正性调控基因，可通过调控促进胚胎晚期毛细胞的发育成熟的转录因子Pou4f3或其他基因来掌控毛细胞的命运和发育[31]。Pou4f3位于Gfil上游，控制着Gfil蛋白在毛细胞中的表达[32]。联合调控Gfi1、Pou4f3和Atoh1，发现多基因的联合调控能够显著提高毛细胞再生的效率[22],表达耳蜗内成熟毛细胞的标志物vGlut3或者Prestin，电生理的研究结果显示新生内毛细胞模拟了耳蜗固有内毛细胞的发育过程[7]。Ikzf2是在耳蜗外毛细胞特异表达的一个基因，其功能突变导致外毛细胞发育障碍[33]。Atoh1和Ikzf2在内耳干细胞中的共同过表达可以使出生后一个月小鼠耳蜗内新生的毛细胞获得比拟出生后1天小鼠外毛细胞的状态[34]。Tbx2是一个在内毛细胞，而不在外毛细胞表达的转录因子，是调控内毛细胞正常分化的核心基因，缺失Tbx2后内毛细胞将不能进行正常分化，反而转变为外毛细胞[35]。Tbx2和Atoh1联用产生的新生vGlut3阳性内毛细胞无论在数量上，还是在分化程度上，都较之前单独Atoh1过表达有显著的提高。

小鼠耳蜗在出生后的成熟发育过程中，支持细胞再生毛细胞的能力大幅下降。p27Kip1缺失与异位Atoh1表达的结合克服了这种年龄相关性的干细胞可塑性下降，使成熟小鼠和噪声损伤后的小鼠支持细胞转化为毛细胞。p27kip1缺失，上调了随年龄增长从内耳干细胞中丢失的Atoh1的辅因子Gata3。Gata3和Pou4f3促进成熟耳蜗中Atoh1介导的毛细胞再生，Pou4f3的单独激活、Gata3与Atoh1的共同激活、Pou4f3与Atoh1的共同激活可以促进成年小鼠支持细胞转化为毛细胞。这表明p27kip1、Gata3和Pou4f3是Atoh1介导的毛细胞再生的共同治疗靶点[36]。此外，Lin28b和Follistatin的短暂共激活能够将成熟耳蜗支持细胞重新编程为祖细胞来增强其再生能力，二者通过上调TGF-β增强了新生小鼠的耳蜗毛细胞的自发性再生[26]。机制上，耳蜗单细胞的转录组学和表观遗传组学分析显示，随着小鼠耳蜗出生后发育，毛细胞基因位点在内耳干细胞中的表观遗传性下降[22],表明需要通过额外的毛细胞转录因子和支持细胞中毛细胞位点的表观遗传调节因子在重新编程期间降低支持细胞基因，从而产生功能性的毛细胞。

4 毛细胞再生疗法

4.1 小分子药物Frequency Therapeutics开发了一种新药FX-322，旨在通过重编程祖细胞来激活人体先天毛细胞再生潜力的疗法来恢复噪声诱发或突发感音神经性相关的听力损失。该研究的主要结果测量是语音感知，这是一种衡量声音清晰度和理解语音的测试听力损失。单剂量FX-322的临床研究表明，语言感知测量的听力有所改善[37]。FX-322是第一个在感音神经性听力损失的临床试验中显示出具有统计学意义和临床意义的听力改善的候选产品，目前处于二期临床试验阶段。除了FX-322上的临床工作，Frequency正在开发一种新的临床前候选药物FX-345，通过毛细胞再生来治疗感觉神经性听力损失。FX-345可以以不同的剂量水平治疗不同的感音神经性听力损失患者群体。

南京大学的万国强团队优化、表征并利用小鼠耳蜗类器官平台，对一千多种FDA批准的小分子药物进行了高通量筛选，发现肿瘤治疗药物瑞戈菲尼能够显著促进耳蜗类器官中毛细胞的分化。进一步的研究发现瑞戈菲尼在小鼠离体耳蜗组织中同样高效促进毛细胞的再生和成熟，而这一过程是由VEGFR-MEK-TGFB1信号轴介导，并不依赖于Notch这一经典的毛细胞再生通路[38]。尽管有一些有希望的发现，功能性毛细胞再生恢复听觉功能暂时仍不能有效实现。

4.2 AAV介导的干细胞再生医学基因递送的理想载体需要将目的核酸片段准确递送至内耳和靶细胞并高效表达。此外，载体还需要转染效率高，强度和时间可控，安全性高等指标要求。2005年，研究者首次使用腺病毒载体将Atoh1基因转染到内耳，发现Atoh1可以通过编码HLH转录因子和与毛细胞发育有关的关键因素来实现耳聋后的部分听力恢复和改善[39]。然而，腺病毒的不能长期表达和潜在的免疫毒性反应限制了其在临床上的应用。Clinicaltrials.gov上显示的正在进行的临床实验中，最常用的体内基因治疗载体是重组腺相关病毒AAV(recombined adeno-associated viruse, rAAV)。AAV载体介导的基因治疗已在美国获批，可用于治疗罕见的遗传性眼病。近年来，研究人员发现了一些理想的可在内耳转染的AAV载体。基于AAV衣壳的原始序列制作了可高效靶向耳蜗毛细胞载体AAV2/Anc80L65,解决了传统AAVs感染外毛细胞效率低的问题[40]。随后又发现具更高感染效力的AAV2.7m8[14]，不仅优先靶向耳蜗毛细胞，还可以有效感染Lgr5阳性支持细胞。Tan等通过插入多肽DGTLAVPFK构建了AAV-DJ的突变体AAV- inner ear(AAV-ie)，通过产生跨膜结构提高感染效率[41]，AV-ie可以有效感染耳蜗毛细胞和前庭毛细胞。此外，研究发现AAV-ie不会影响毛细胞和听觉系统的功能，其在纠正遗传性听力损伤和毛细胞再生治疗方面具有重要的潜力。AAV-ie是能够将外源Atoh1递送至内耳干细胞中，体内实现内耳干细胞向毛细胞的转化等[41]。然而，AAV-ie对支持细胞的非特异靶向性限制了其在功能性毛细胞再生中的应用，相同滴度下AAV-ie可以以几乎100%的比例转导毛细胞和螺旋神经元。因此，开发高效特异靶向支持细胞的AAV对基于支持细胞，即内耳干细胞的再生医学研究至关重要。

5 结论与展望

耳蜗毛细胞的受损和缺失，是造成感音神经性聋的核心原因之一。成年哺乳动物的耳蜗毛细胞属于终末分化细胞，其受损缺失后不能自发再生得到补充。治疗感音神经性聋最理想的方法是通过干细胞使毛细胞再生，从而使耳蜗结构和功能修复，从而在根本上恢复听力。因此，如何激活并调控干细胞，使其有效增殖分化，再生为功能性毛细胞，是听觉损伤修复的关键之处。对于损伤后内耳干细胞的命运调控解码和临床上适用的治疗方式的开发，将极大地推进通过干细胞修复听觉损伤重建听觉功能从基础研究走向临床转化。