二代测序技术在Cardio-facio-cutaneous综合征诊断中的应用研究*

肖 海，张照婧，吕 雪，李 涛，郭谦楠，侯巧芳，王红丹，刘红彦，霍晓东，廖世秀△

(1．河南省人民医院医学遗传研究所，郑州 450003；2．郑州大学基础医学院医学遗传与细胞生物学系，郑州 450003；3．河南省人民医院健康管理科，郑州 450003)

Cardio-facio-cutaneous综合征(CFC)与Costello综合征(CS)、Noonan综合征(NS)一起被归类为RAS心肌病群[1-2]。该病群的临床表型有很多相似之处，患者均可表现出不同程度的智力发育异常、心脏发育异常及身材矮小等临床症状。虽然该病群疾病也有各自相对特异性的表征，但是仅仅凭借表型进行诊断还是十分困难。本文利用比较基因组杂交技术(aCGH)结合二代测序技术(NGS)对1例疑似NS患者进行检测，并结合临床表型诊断为CFC，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 患儿，女，1岁11月，汉族，因生长发育迟缓就诊于河南省人民医院医学遗传研究所。患儿系G1P1，孕27周超声提示永久性右脐静脉，羊水过多，羊水最大深度82 cm，羊水指数319 mm。足月顺产。出生后偶有抽搐发作，1月时磁共振(MRI)脑部平扫未见明显异常。患儿运动发育滞后，1岁时头部CT结果提示：(1)考虑复合脑积水征象；(2)左顶部头皮下血肿。1岁11月时心脏超声检查提示：(1)左房稍大；(2)左室壁弥漫性增厚；(3)左室流出道流速稍增快；(4)左室舒张功能减低。患儿眼距稍宽，鼻梁塌平，外侧眼角偏下，头发稀疏，父母非近亲结婚，否认遗传病家族史，见图1。本研究经医院伦理委员会批准，患者及家属知情同意并签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1DNA提取 签署知情同意书后，分别抽取患儿及其父母外周血各2 mL，EDTA抗凝。采用DNA提取试剂盒(Dneasy Tissue Kit DNA，德国Qiagen公司)提取外周血DNA，采用Nandrop 2000分光光度计(美国Thermo公司)进行DNA定量检测。

1.2.2aCGH检测分析 应用Human genome CGH Microarray 8X60K芯片(美国Agilent公司)对患儿进行检测，采用Microarray Scanner(美国Agilent公司)及其他配套软件对芯片进行扫描和初步分析，检索UCSC、DECIPHER、ISCA等数据库对检测出的缺失、重复进行比对及致病性鉴定。

1.2.3NGS高通量测序 根据参考文献[3]，取3 μg患者的DNA构建测序文库。用Nanodrop 2000分光光度计对文库标本进行定量检测。文库经PCR扩增后，应用心肌病相关基因检测试剂盒(北京迈基诺基因科技公司)进行检测，Illumina HiSeq2000 基因分析系统(美国Illumina公司)上机测序。

图1 患儿面部图

1.2.4Sanger测序 按照Sanger法检测患儿及其父母的BRAF基因c.1406位点。GenBank上查找BRAF基因序列，用NCBI上的在线软件Primer-BLAST设计引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成，上游引物5′-TTG GGA GAT TCC TGA TGG GC-3′，下游引物5′-TTG GAG GAG TCC TGA AAC TAA TCA-3′。PCR体系为25.0 μL，其中DNA模版1.0 μL，上下游引物各0.5 μL，2X Taq DNA mix 12.5 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR条件:95 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火35 s，72 ℃延伸50 s，循环35次；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。所有标本的PCR产物经纯化后利用ABI3130基因分析仪进行测序。测序结果与NCBI上的标准序列进行BLAST分析。

2 结 果

2.1aCGH检测情况 患儿染色体未发现拷贝数变化，为一正常女性，见图2。

图2 患儿aCGH检测情况

2.2突变位点检测 二代测序结果显示,在chr7-140481402位点即BRAF基因第11外显子c.1406处存在G>A杂合突变(红色区域)，见图3。该突变导致基因编码的第469位密码子由甘氨酸变为谷氨酸，即p.G469E。经查阅相关数据库已有该位点相关致病性报道。

2.3Sanger法测序 利用Sanger法对患儿的NGS结果进行验证，发现患儿BRAF基因第11外显子存在c.1406 G>A杂合突变(图4A)，Sanger法检测患儿父母的BRAF基因c.1406位点，发现其父母该位点均为G/G野生型(图4B、4C)。

图3 患儿突变位点检测

A：患儿BRAF基因c.1406G>A杂合突变(红圈处)B：患儿父亲BRAF基因c.1406位点为G/G野生型(红圈处)；C：患儿母亲BRAF基因c.1406为G/G野生型(红圈处)

图4 BRAF基因c.1406位点反向测序情况

3 讨 论

染色体不平衡的拷贝数变异(copy number variants,CNVs)与原因不明的发育迟缓、智力低下、多种体征畸形及自闭症患者关系密切。2010年，国际细胞基因组芯片标准协作组推荐将aCGH作为这类患者的临床首选检测方法[4]。由于临床诊断不明确，并且患儿存在先天性心脏病、生长发育迟缓、智力障碍等症状，为了避免漏检，笔者先用aCGH技术在全基因组水平对患儿进行检测，检测是否存在CNVs。aCGH检测结果显示，患儿染色体未发现拷贝数变化，排除CNVs导致的先天性心脏病、生长发育迟缓、智力障碍。

RAS心肌病群中的3种疾病在临床症状上有太多相似之处，本研究中的患儿具有典型的智力发育迟缓、心脏发育异常等，临床医生根据症状很难做出明确诊断，疑似为NS。虽然3种疾病的表型相似，但是致病的分子机制却不同，并且RAS心肌病群中的疾病具有遗传异质性的特点，比如CFC主要是由4种基因突变导致的，分别为BRAF、MAP2K1、MAP2K2和KRAS[5]。如果利用一代测序技术对3种疾病的致病基因外显子逐一进行检测，需要的工作量十分巨大。与一代测序不同，NGS凭借其通量大、速度快等优点，在分子生物学研究、疾病的诊断等方面发挥了重要作用，已用于复杂性神经系统疾病、恶性肿瘤、免疫检测及微生物学研究等领域[6]。因此本研究选择利用NGS技术同时对3种疾病的致病基因进行检测。

NGS结果显示，患儿BRAF基因第11外显子存在c.1406 G>A杂合突变。该突变为错义突变，导致该基因编码的第469位氨基酸由甘氨酸变为谷氨酸，即p.G469E。2006年，NIIHORI等[7]在4例CFC患者中检查到该突变。利用Sanger法对患儿的NGS结果进行验证，二者结果一致说明二代测序结果准确可信。甘氨酸为极性不带电氨基酸，谷氨酸为极性带负电氨基酸，氨基酸的改变会对基因编码的蛋白空间结构造成影响，进而影响蛋白的正常功能。BRAF是RAS-RAF-MEK-ERK通路的关键调控因子，该通路对细胞的增殖、生长、凋亡十分重要[8]。目前研究显示，CFC患者中近75%为BRAF基因突变导致的，近25%为MAP2K1基因和MAP2K2基因突变导致的，2%～3%为KRAS基因突变导致[9-10]。利用Sanger法对患儿父母的BRAF基因c.1406位点进行检测，发现其父母该位点均为野生型，说明患儿为自发突变导致的CFC。

CFC是一种常染色体显性遗传病，该病于1986年首次报道[11-12]。目前关于CFC的报道特别少，在全世界范围的发病率不详，有文献报道日本CFC的发病率估计为1/810 000[13]。其常见的临床表现为先天性心脏病、生长发育迟缓、智力障碍、皮肤异常等[14]。CFC最早的临床特征为胎儿期超声提示胎儿颈部透亮度增加，有时为囊状水瘤，67%可见羊水过多[15]，50%患儿早产。

综上所述，结合基因检测结果与临床资料，本研究患儿排除NS，应为CFC。在对于临床症状相似但致病基因不同的疾病诊断过程中，NGS技术可以起到很好的辅助诊断作用。

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