BAK/cFLIP在女性压力性尿失禁患者尿道周围肌细胞中的表达及意义

贾慧 王鲁文 桑庆娜 聂让让 候亚楠 夏小飞 宋易坤

尿失禁即膀胱内的尿不能控制而自行流出，较为常见，中老年女性是尿失禁的高发人群，其发病率已超过高血压、抑郁症和糖尿病等常见疾病[1]。该病的主要症状是尿液自行流出，可分为混合性尿失禁、急迫性尿失禁和压力性尿失禁3种类型。其中 SUI是指当用力、咳嗽或打喷嚏等腹压增高时有尿液漏出[2]。SUI是尿失禁最常见的类型，约占尿失禁构成比的一半左右[3]；该病不仅影响患者下尿路的正常功能，还会对患者的心理造成极大的负面影响，导致患者生活品质急剧下降，甚至无法正常生活。SUI是一种多因子疾病，其发病率与患者年龄、病史、妊娠史、雌激素水平、遗传等多个因素相关，而引起SUI的直接原因目前尚无定论。本研究通过检测凋亡相关基因蛋白BAK、cFLIP在尿道周围肌组织中的表达情况，探讨SUI与BAK、cFLIP之间的关系，为该病的诊断和治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 一般资料选择2016年12月～2017年3月我院妇科收治的SUI患者20例作为观察组，所有患者均已停经。在手术过程中，取患者12点方位1.0cm×1.0cm阴道壁全层组织，其中POP-Q 评分<Ⅱ度（单纯SUI组）15例，POP-Q评分≥Ⅱ度（SUI+POP组）5例。选择同期因子宫肌瘤、卵巢良性肿瘤、CIN等除恶性肿瘤外妇科疾病住院，已停经但无POP或SUI患者20例（POP-Q 评分<Ⅱ度）作为对照组，取患者阴道前壁12点方位大小约1.0cm×1.0cm全层组织标本。所有患者术前对本研究均知情同意；患者近半年未服用激素类药物，未行盆底手术，无急性炎症病史，排除恶性肿瘤疾病。各组患者年龄、妊娠史、BMI比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表 1。

表1 各组患者一般资料对比（±s）

表1 各组患者一般资料对比（±s）

组别例数年龄（岁）孕次产次BMI（kg/m2）SUI组 1544.60±6.584.20±1.482.40±0.5427.60±1.51 SUI+POP组 552.66±3.784.00±1.002.33±0.5729.66±2.08对照组 2050.00±6.514.38±0.832.20±0.4428.00±2.12

1.2 标本处理患者的标本采集自同一部位，大小相同，但保存方式有所不同。用于行免疫组化检测的标本放入甲醛溶液中进行固定，浓度为10%，随后用石蜡将其包埋，经过切片、染色后，在光学显微镜下进行观察并筛选；用于行qRT-PCR检测的标本直接放入液氮冷冻，并于-80℃环境中保存。

1.3 免疫组化SP法检测BAK、cFLIP蛋白的表达BAK多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，cFLIP多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，所有试剂采购自中山金桥生物技术有限公司，检测各组标本中BAK、cFLIP表达时均采用SP二步法，按照操作规范进行操作。用电磁炉对切片进行处理，切片脱蜡水化后，用pH值为6.0、浓度为0.01mmol/L的柠檬酸盐缓冲液连续修复20min。为阻断过氧化物酶，需采用浓度为0.3%的过氧化氢，随后用山羊血清封闭标本，并进行孵育。使标本在4℃的环境下过夜，随后向标本中添加二抗及链霉素-过氧化物酶，经过显色和复染后才能封片。用已知子宫内膜阳性切片做BAK、cFLIP阳性对照；以PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。BAK、cFLIP蛋白经染色后呈现出颗粒状，以黄色为主，也有部分棕褐色。细胞浆表达出来的信号大多数为阳性信号，观察细胞时随机选择5个视野，视野倍数为400倍，根据标本的阳性细胞和染色强度对其进行定量处理。按照颜色的深浅进行强度评分，分值为0～3分，0分表示基本不着色，1分表示显色为淡黄色，2分表示显色为棕黄色，3分表示显色为棕褐色。按照阳性细胞数量的多少进行评分，分值为0～3分，0分表示阳性细胞占比<5%，1分表示阳性细胞占比≥5%且＜20%，2分表示阳性细胞占比≥20%且＜50%，3分表示阳性细胞占比为≥50%。两种评分得 分 相 加，0～1分（-），2分（+），3～4分（++），5～6分（+++）。

1.4 qRT-PCR法检测BAK、cFLIP的表达Trizol试剂盒、逆转录试剂盒及SYBR Master Mix均购自美国GeneCopoeia公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，生物分光光度仪为美国Thermo公司产品，Applied Biosystems Plus One型qRT-PCR仪为美国GeneCopoeia公司产品。RNA提取和检测：首先将患者的阴道前壁组织在液氮环境中进行研磨，直至阴道前壁组织变成粉状为止，然后用RNA提取试剂从该组织中提取RNA，并检测RNA的浓度，所需工具为紫外分光光度计。细胞逆转录和扩增：根据说明书中的方法，将总RNA在37℃下经过1h的孵育逆转录成 cDNA，从原来的 1μl变成 10μl。PCR反应：以GAPDH 作为内参，GAPDH上游引物序列为：5'-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3'，下游引物序列为：5'-GGTGGAATCATATTGGAACA- 3'；BAK的上游引物序列为：5'-ATGGTCACCTTAC CTCTGCAA-3'，下游引物序列为：5'-TCATAGCGTCGG TTGATGTCG-3'； cFLIP的上游引物序列为：5'-GAGCAAGCCCCTAGGAATCT-3'，下游引物序列为5'-GGCAGAAACTCTGCTGTTCC-3'。取 cDNA 1μl，总反应容量为 20μl，反应持续 15min，在95℃的环境下进行，循环总量为40个。分析结果时，采用Ct值法，直接取2-ΔCt 。

1.5 统计学方法采用SPSS 21.0统计软件，计数资料比较采用卡方检验，计量资料比较采用组间LSD检验、单因素方差分析。阴道前壁组织中BAK和cFLIP表达水平的关系分析采用Pearson分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组BAK和cFLIP的表达免疫组化法检测结果显示，阴道前壁组织中的BAK和 cFLIP主要定位于细胞浆。BAK的表达情况：观察组样本中发现颜色较深、黄色的阳性细胞且分布相对密集，明显高于背景颜色，对照组中细胞着色为淡黄色至黄色，表达低下，分布稀疏，呈低表达状态；cFLIP蛋白则相反，见图1。SUI组、SUI+POP组分别与对照组比较，BAK和cFLIP的阳性表达率差异均有统计学意义（P<0.05），而 SUI组与 SUI+POP组比较，BAK和cFLIP的阳性表达率均无统计学差异（P>0.05）。各组BAK和cFLIP阳性表达情况见表2。

表2 各组BAK和cFLIP阳性表达情况[n（%）]

2.2 各组qRT-PCR检测结果qRT-PCR检测BAK、cFLIP表达水平显示，SUI组和SUI+POP组分别与对照组比较，BAK和cFLIP表达水平差异均有统计学意义（P<0.05），而 SUI组与 SUI+POP组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。各组BAK和cFLIP基因表达量见表3。

表3 各组BAK和cFLIP的mRNA相对表达量比较（±s）

表3 各组BAK和cFLIP的mRNA相对表达量比较（±s）

注：与SUI+POP组比较，aP=0.606、0.650；与对照组比较，bP=0.000、0.010；与对照组比较，cP=0.000、0.020

组别 n BAK表达量 cFLIP表达量SUI组 15 0.0045±0.0042ab0.0012±0.0011ab SUI+POP组 5 0.0048±0.0045c0.0010±0.0011c对照组 20 0.0011±0.0009 0.0056±0.0048

2.3 BAK和cFLIP在阴道前壁组织中表达的相关性BAK和cFLIP在阴道前壁组织中的表达呈负相关（r=-0.211，P<0.05）。

图1 免疫组化显示BAK、cFLIP在各组中的表达情况（SP，×400）

3 讨论

从本质上来说，细胞凋亡是一个自然的过程，有利于维持组织的正常形态，在维持器官正常功能中发挥着至关重要的作用。但过量的细胞凋亡则十分有害，它可能会引发各种恶性疾病，如恶性贫血、神经类疾病，甚至是艾滋病。为有效抑制细胞的持续凋亡，必须尽可能减少死亡配体受体的数量或抑制Caspase活性。随着医疗技术不断进步及相关研究的进一步深入，由平滑肌损伤引发的细胞凋亡报道较多[4，5]。事实上，平滑肌是一个力学结构，它与人体阴道前壁的性能密切相关，甚至决定了阴道的功能[6]。了解平滑肌和纤维组织细胞凋亡的生物特性有助于制定新的治疗策略。

BAK是Bcl-2家族中的一员，存在于染色体上。研究发现，BAK长度约为6kb，外显子至少有3个。BH1、BH2、BH3分别是BAK不同的功能区域。BAK基因促进细胞凋亡的作用机理为：BAK的两个功能区域和Bcl-2结合，形成了新的二聚体，使得Bcl-2原本的作用有所减弱，而抑制细胞凋亡活性是Bcl-2的主要功能。随后，BAK的另外一个功能区域，即BH3将会发挥作用增强的角色，其主要作用是激活人体中的半胱氨酸蛋白酶，加速细胞凋亡[7]。由此可见，BAK参与了细胞凋亡的整个过程[8]。

cFLIP同样位于人体染色体上，cFLIP的信使RNA有很多种亚型。然而，在基因表达过程中，呈现出来的亚型仅有两种，一种是短型的cFLIPs，另一种则是长型的cFLIP1[9]。从结构上看，cFLIP和Caspase-8有较多的相似之处。因此，在与DED结合的过程中，cFLIP也在和Caspase-8竞争，它可以阻止DISC形成，而DISC的主要作用是阻断细胞死亡。就目前而言，Fas-FasL凋亡途径较为清晰[10]。

无论BAK蛋白还是cFLIP蛋白，其参与凋亡过程都与半胱氨酸蛋白酶有关。事实上，半胱氨酸蛋白酶是一种蛋白水解酶，在细胞凋亡过程中发挥着至关重要的作用。功能区域与Bcl-2的结合首先会形成新的二聚体，继而使半胱氨酸蛋白酶重新被激活。一旦半胱氨酸蛋白酶被激活，就会进行胞质重组、染色质凝集等一系列活动，从而加速细胞凋亡。从结构上看，cFLIP蛋白和Caspase-8有较多相似之处，因此，cFLIP蛋白可以阻止诱导细胞死亡的复合体形成，从而降低细胞凋亡的速度。

有研究表明， 细胞凋亡是引起SUI的主要因素之一[11]。随着年龄的不断增长，女性横纹肌细胞将会不断减少，取而代之的是一些结缔组织或脂肪组织。有研究发现[12]，雌激素降低可能为细胞凋亡的直接诱因，通过观察大鼠阴道上皮细胞可知，上皮细胞的雌激素水平并不是固定不变的，而是随着月经周期的时间而发生改变。因此，在不同时期，细胞凋亡率也会有所不同。事实表明，月经期间的细胞凋亡率较低，但是月经结束后，细胞凋亡率就会随之上升。一般来说，由于雌激素水平下降而引起的细胞凋亡常见于尿道上皮细胞，它不会对其它细胞凋亡产生影响。本研究结果显示，尿道周围肌细胞凋亡的现象普遍存在，BAK与cFLIP在尿道前壁组织中的表达呈负相关。

综上所述，尿道周围平滑肌和纤维组织中BAK表达增加可能参与了压力性尿失禁发生发展进程，抑制BAK表达可能为诊治压力性尿失禁提供新的思路。然而，尿道下组织和上皮细胞的凋亡过程是否一致，雌激素水平的变化规律是否相同，仍有待证实。

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3 刘春燕，朱兰，郎景和.女性尿失禁流行病学调查及发病相关因素研究进展 [J].中华妇产科杂志，2007，42（2）：142-144

4 Dai H，Ding H，Meng XW，et al.Contribution of Bcl-2 Phosphorylation to Bak Binding and drug resistanc[J].Cancer Res Cancers，2013，73（23）：234-237

5 Lehner M，Kellert B，Prodd J，et al.Autocrine TNF is critical for the survival of human dendritic cells by reguating BNK，BCL-2，and FLIP[J].J Immunol，2012，188（10）：810-818

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7 Maiese K.Driving neural regeneration through the mammalian target of rapamycin[J].Neural Regen Res，2014，9（15）：1413-1417

8 Hiona A，Leeuwenburgh C.The role of mitochondrial DNA mutations in aging and sarcopenia：implications for the mitochondrial vicious cycle theory of aging[J].Exp Gerontol，2008，43（1）：24-33

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11 Strasser H，Tiefenthaler M，Steinlechner M，et al.Urinary incontinence in the elderly and age dependent apoptosis of rhabdosphincter cells[J].Lancet，1999，354（9182）：918-919

12 Resplande J，Gholami SS，Graziottin TM，et al.Long-term effect of ovariectomy and simulated birth trauma on the lower urinary tract of femalerats[J].J Urol，2002，168（1）：323-330