顶空气相色谱法测定selexipag中6种有机溶剂残留量

李丽丽，王洪朋，田海伟，李 晋，高双双，哈 婧

(河北科技大学化学与制药工程学院，石家庄 050018)

肺动脉高压是以血管增殖、重塑、原位血栓形成、肺血管床进行性闭塞和肺血管阻力进行性增加为特征的肺小动脉疾病。Selexipag是由日本新药株式会社和爱可泰隆医药公司联合开发的一种前列环素受体(PGI2)激动剂[1]。该药于2015年12月21日获美国食品药品监督管理局(FDA)批准上市，又于2016年5月12日获欧洲药品管理局(EMA)批准上市，用于治疗肺动脉高压。Selexipag化学名为2-{4-[(5,6-二苯基吡嗪-2-基)(异丙基)氨基]丁氧基}-N-(甲基磺酰基)乙酰胺，药理作用为舒缓血管壁平滑肌从而扩张血管，增加肺部供血[2]。Selexipag及其活性代谢产物对IP-受体的选择性优于其他前列腺素受体，被FDA授予孤儿药地位[3]。其结构式见图1。

Figure1 Chemical structure of selexipag

Selexipag在合成过程中使用了6种溶剂[4-5]，其中4种第二类溶剂(甲醇、二氯甲烷、四氢呋喃、甲苯)，2种第三类溶剂(乙醇、丙酮)。目前尚未见有关selexipag原料药残留溶剂的检测方法报道，为有效控制产品质量、保证用药安全，本研究参考人用药物注册技术要求国际协调会(ICH)的有机溶剂残留量研究指导原则和《中华人民共和国药典》(2015年版)四部通则[6]，采用顶空毛细管气相色谱法[7-10]对selexipag原料药中6种残留溶剂进行测定，建立了selexipag原料药中甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、四氢呋喃和甲苯顶空气相色谱测定方法，并进行了方法学验证[11]，结果表明，该方法分离度好，精密度高、加样回收率结果满意，适用于selexipag原料药中6种残留溶剂的测定，并为保证用药安全，进一步控制3类有机溶剂的残留量提供了科学依据。

1 材 料

1.1 药品与试剂

Selexipag原料药为河北省药用分子重点实验室自制，批号分别为20160813、20160911、20160918。其他试剂均为分析纯。

1.2 仪 器

GC7900气相色谱仪(中国天美科学仪器有限公司)；DK3001A顶空进样器(中国北京中兴分析仪器新技术研究所)；GH-30高纯氢发生器、GA-2000A 低噪音空气泵(中国北京中兴汇利科技发展有限公司)；AL204万分之一电子天平(瑞士Mettler公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及测定方法

色谱柱为Kromat PC-624(V)毛细管柱(固定相为6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷，30.0 m×0.32 mm,1.8 μm)；进样口温度:200 ℃，检测器温度:250 ℃；柱温：初始温度为40 ℃，保持5 min，以20 ℃/min的速率升温至180 ℃，保持5 min；载气：高纯氮气；进样方式:顶空进样，定量环1 mL；平衡温度:80 ℃，平衡时间:30 min；阀箱温度:100 ℃，传输线温度:110 ℃。

精密量取对照品溶液或供试品溶液5 mL，密封于20 mL顶空瓶中，经顶空平衡后，量取其顶端气体，注入气相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积来计算各残留溶剂的含量。

2.2 溶液制备

2.2.1 混合对照品溶液制备 称取甲醇约1.5 g、无水乙醇约2.5 g、二氯甲烷约0.3 g、四氢呋喃约0.36 g、丙酮约2.5 g、甲苯约0.5 g，精密称定，各置50 mL量瓶中用二甲基亚砜溶解定容；精密量取上述溶液各1 mL置10 mL量瓶中用二甲基亚砜定容至刻度，作为混合对照品储备液。精密吸取上述对照品储备液0.4 mL置10 mL量瓶中用二甲基亚砜定容至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液制备 取selexipag原料药约0.2 g，精密称定，置20 mL顶空瓶中，精密加入二甲基亚砜5 mL使样品溶解，摇匀，密封，即得。

2.3 系统适应性试验

取空白溶剂二甲基亚砜、混合对照品溶液、供试品溶液，按“2.1”项色谱条件及进样方法进行分析，结果表明空白溶剂无干扰，限度混合对照品溶液中各色谱峰的理论塔板数均大于5 000，各相邻峰的分离度大于1.5，色谱图见图2。

2.4 线性关系考察

精密量取混合对照品储备液1，3，5，7，10 mL分别置于100 mL量瓶中，加二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀，作为系列标准线性溶液，分别精密量取5 mL 置20 mL顶空进样瓶中，密封，摇匀，按“2.1”项色谱条件及进样方法进行分析，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，进行线性回归，结果见表1。

Figure2 HPLC of blank solution(A)，mixed solvent(B)and selexipag test solution(C)

1：Methanol;2：Ethanol;3：Acetone;4：Dichloromethane;5：Tetrahydrofuran;6：Toluene;7：Dimethy-lsulfoxide

Table1 Results of linearity test for the mixed solvent

SolventLinearequationrLinearrange/(μg/mL)MethanolY=2074X+0041210003207⁃3201EthanolY=2599X-0065610005010⁃5010AcetoneY=1698X-361610005164⁃5164DichloromethaneY=03131X-05616099826080⁃6076TetrahydrofuranY=2162X-3276099917590⁃7588TolueneY=1431X-2858099861076⁃1076

2.5 精密度试验

精密量取混合对照品溶液5.0 mL，分别置于20 mL顶空瓶中，平行制备6份作为精密度试验溶液，按“2.1”项色谱条件及进样方法进行分析，计算各被测组分甲醇、乙醇、二氯甲烷、丙酮、四氢呋喃、甲苯峰面积的RSD(%，n=6)，分别为2.9，3.0，3.2，2.4，2.5和3.1，表明色谱系统精密度良好。

2.6 重复性试验

取selexipag原料药(批号20160813)约0.2 g，按“2.2.2”项配制供试品溶液6份，按“2.1”项色谱条件及进样方法进行分析，记录色谱图按外标法进行计算。结果甲醇、二氯甲烷、丙酮、四氢呋喃、甲苯均未被检出，乙醇的平均含量为0.3%，RSD为2.0%(n=6)，表明系统重复性良好。

2.7 供试品稳定性试验

取selexipag原料药(批号20160813)约0.2 g，按“2.2”项配制供试品溶液5份，按“2.1”项色谱条件及进样方法进行分析，考察样品溶液8 h之内的稳定性。结果甲醇、二氯甲烷、丙酮、四氢呋喃、甲苯均未被检出，乙醇的平均含量为0.3%，RSD为1.7%(n=5)，表明样品在8 h内稳定性良好。

2.8 检出限与定量限

取各对照品储备液，用二甲基亚砜逐级稀释，按“2.1”项色谱条件及进样方法进行分析，以信噪比S/N=10为定量限，甲醇、乙醇、二氯甲烷、丙酮、四氢呋喃、甲苯定量限(μg/mL)分别为16.0，25.15，28.82，3.03，28.45，26.90。以信噪比S/N=3为检测限(μg/mL)分别为1.60，2.50，2.58，1.51，5.69，5.38。

2.9 定量限精密度试验

分别精密量取甲醇、乙醇、二氯甲烷、丙酮、四氢呋喃、甲苯定量限溶液，按“2.1”项色谱条件及进样方法进行分析，计算甲醇、乙醇、二氯甲烷、丙酮、四氢呋喃、甲苯定量限峰面积的RSD(%，n=3)，分别为2.5，1.9，2.2，3.4，2.8和3.5，表明定量限精密度良好。

2.10 准确度试验

精密量取对照品储备液0.32，0.40，0.48 mL置于10 mL量瓶中加入二甲基亚砜定容至刻度。精密称取20160813批样品约0.2 g，共9份，分别精密加入上述试液5 mL，每个浓度平行3份，密封、摇匀，按“2.1”项色谱条件及进样方法进行分析，记录色谱图，按外标法进行计算，结果见表2。

2.11 样品测定

取selexipag原料药3批(批号分别为20160813、20160911、20160918)，按“2.2.2”项制备供试品溶液，每批2份按“2.1”项色谱条件及进样方法进行分析，按外标法计算3批样品中乙醇的含量分别为0.3%，0.3%，0.4%，甲醇、二氯甲烷、丙酮、四氢呋喃、甲苯均未被检出。

Table2 Recovery of six residual solvents of selexipag(n=9)

SolventAveragerecovery/%RSD/%Methanol9967249Ethanol9872324Acetone10167249Dichloromethane9864136Tetrahydrofuran9784146Toluene9857164

3 讨 论

3.1 进样方式选择

Selexipag采取直接进样模式时，甲醇色谱峰拖尾严重，与乙醇分离度较差，而且由于样品质量浓度较大，直接进样易造成色谱柱污染，所以采取顶空进样方式。

3.2 溶剂的选择

Selexipag水溶性较差，不能用水作溶剂直接进样，N，N-二甲基甲酰胺作溶剂时各溶剂峰之间分离度不理想；而用二甲基亚砜作溶剂时对待测的6种溶剂无干扰回收率好，各溶剂峰形较好，最终选择二甲基亚砜作为试验溶剂。

3.3 顶空平衡温度的选择

固定顶空平衡时间30 min，考察平衡温度分别为80，90，100 ℃时各待测溶剂的色谱峰面积的变化。随着平衡温度的提高，色谱峰面积没有明显增高的趋势，考虑到温度过高会使药物分解影响分析结果，且待测溶剂均可在80 ℃条件下全部检出，故将平衡温度设为80 ℃。

3.4 顶空平衡时间的选择

固定平衡温度80 ℃，分别考察平衡时间为20，30，40 min，各待测溶剂的色谱峰面积的变化结果表明，平衡时间为30和40 min时，待测组分峰面积明显高于20 min，但30 min和40 min平衡时间测定的待测溶剂峰面积没有明显差异，故将平衡时间设为30 min。

3.5 顶空进样瓶中溶剂体积的选择

顶空瓶中分别加入溶剂3，4，5 mL，考察峰面积变化情况，结果表明加入5 mL溶剂时峰面积明显高于3 mL，4 mL。因考虑到气液平衡及进样针的位置问题并没有继续考察加大溶剂量的情况，最终选择5 mL作为进样瓶中的溶剂体积。

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