穿心莲内酯对糖尿病肾病小鼠的治疗作用及机制

李梦诗，吴 腾，曹静桦，何亚军，亓翠玲，王丽京

(广东药科大学基础学院血管生物学研究所，广州 510006)

糖尿病是常见的内分泌疾病，在全球流行性疾病中仅次于心脑血管疾病、肿瘤、艾滋病位列第4，严重威胁着人类健康[1]。糖尿病肾病是糖尿病最常见的并发症，也是导致终末期肾病的重要因素，最终导致肾衰竭[2]。肾小球系膜细胞是肾小球的主要功能细胞，无论是在肾脏的生理功能或是病理变化中都发挥着重要作用。由肾小球系膜细胞的过度增生及细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的过度积累所导致的肾小球硬化是糖尿病肾病的主要病理特点，通常伴有蛋白尿和肾小球滤过率下降等临床表现[3-6]。纤维粘连蛋白(fibronectin,FN)是ECM的主要成分，是评价ECM累积的重要指标[7]。有研究报道糖尿病患者机体内氧化应激水平有升高的趋势，可以在糖尿病肾病患者肾脏中检测到活性氧化物质(reactive oxygen species,ROS)增高。有研究提示，在糖尿病动物模型中，通过抑制肾脏ROS水平可有效改善肾小球和肾小管的病理性改变[8]。亦有研究表明,NAPDH氧化酶4(NOX-4)是肾脏细胞ROS产生的主要途径之一[9-13]。

穿心莲属爵床科穿心莲属植物，其主要有效成分为穿心莲内酯(andrographolide，Andro)，是一种二环双萜内酯类化合物。中医认为穿心莲属于寒性药物，有消热排毒的疗效。近年研究表明Andro具有抗炎的作用，并对动脉粥样硬化、高血压及肿瘤有一定疗效及抑制作用[14-16]。此外。Andro还被发现能够在1型糖尿病中发挥保护胰岛β细胞的功能及减缓NOD小鼠自发免疫性糖尿病的病理进程[17-18]。另外，也有研究证实Andro能通过减少细胞ROS产生，从而在体内/体外达到治疗与氧化应激相关疾病的目的[19-21]。目前，Andro对糖尿病肾病的作用尚未见报道，本研究利用自发糖尿病转基因Leprdb/db小鼠，研究Andro对Leprdb/db小鼠糖尿病肾病的作用及其机制。

1 材 料

1.1 试 剂

穿心莲内酯粉末(美国Sigma公司)溶解于DMSO中，配成质量浓度为200 mg/mL的溶液，使用时蒸馏水稀释1000倍；24 h尿蛋白检测试剂盒、肌酐检测试剂盒和尿素氮检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；苏木精染液、小鼠及兔二抗、DAB显色试剂(北京中杉金桥生物有限公司)；BSA[生工生物工程(上海)股份有限公司]，4%多聚甲醛溶液(博士德生物工程有限公司)。

1.2 仪 器

PR-MBJ-1全自动生物组织包埋机(PR公司)；石蜡切片机(德国Leica公司)；独立送回风净化笼具IVC与小鼠代谢笼(苏杭科技器材有限公司)；倒置显微镜(日本Olympus公司)；冷冻高速离心机(德国Eppendorf公司)；酶标仪(美国Bio Tek公司)。

1.3 动 物

转基因小鼠Leprdb/db小鼠购自南京大学模式动物研究所(Jackson实验室货号000642)，C57BL/6小鼠购自广东省动物中心，许可证号：SCXK(粤)2013-0002。小鼠自购买后均饲养于SPF级实验动物环境中，光照时间为12 h/12 h昼夜交替。所有动物实验均符合动物伦理委员会标准。

2 方 法

2.1 小鼠分组及给药

选用18周龄体重在42～48 g的雄性Leprdb/db小鼠，剪指做好标记，将小鼠随机分为两组，一组每两天腹腔注射1 μg/g Andro至26周[7]，另一组则注射DMSO溶解的相同体积的生理盐水至26周，另外，选用同样周龄的体重在28～32 g雄性C57BL/6小鼠作为阴性对照组。每组各7只。

2.2 肌酐、尿素氮，尿蛋白含量的测定

治疗8周后，将小鼠置于代谢笼中24 h，从收集尿液的瓶子中取出尿样，进行尿蛋白和尿素氮的检测。将小鼠眼眶取血，4 000 r/min离心取上清液，检测血清中的肌酐水平。

用AU800全自动生化分析仪检测血肌酐、尿素氮。其中血肌酐采用苦味酸法，尿素氮采用脲酶法。

24 h尿蛋白定量：采用考马斯亮蓝法检测实验小鼠24 h尿蛋白含量。

2.3 苏木精-伊红(HE)染色

石蜡切片梯度脱蜡，水化，苏木精染色1分30秒，流水返蓝1 h，伊红染色15秒，流水冲洗3遍，脱水透明，中性树脂封片。

2.4 过碘酸-希夫(PAS)染色

石蜡切片梯度脱蜡至水，蒸馏水洗1～2 min，过碘酸溶液氧化10 min，流水洗10 min，希夫(Schiff)试剂染色10 min，流水洗5 min，苏木精染核2 min，流水冲洗10 min，常规脱水、透明、封片。

2.5 免疫组化

石蜡切片脱蜡后，用PBS洗3次，每次5 min。高压修复5 min。PBS洗后，用3%过氧化氢-甲醇37 ℃孵育30 min。PBS洗3次，每次5 min，10%BSA封闭。一抗(1%BSA稀释1∶100)4 ℃冰箱孵育过夜。第2天，复温后，PBS洗，37 ℃烘箱孵育相应二抗(1%BSA稀释1∶100)40 min。DAB显色，苏木精染核后，脱水、透明、封片。

PAS染色及免疫组化染色，由Image-Pro Plus统计积分光密度(integrated optical density，IOD)。

2.6 统计学处理

采用GraphPad Prism 5.0软件对数据进行单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 Andro对Leprdb/db小鼠的24 h尿蛋白、血肌酐和血尿素氮水平的影响

用Andro治疗Leprdb/db小鼠，随机分为两组，一组每2天腹腔注射1 μg/g Andro至26周，另一组则注射相同体积DMSO溶解的的生理盐水。治疗后发现Andro治疗组的24 h尿蛋白(P<0.001)、血肌酐(P<0.05)和血尿素氮(P<0.01)水平比对照组明显降低(图1)。

3.2 Andro对Leprdb/db小鼠肾小球病理性变化的影响

治疗结束后取材，石蜡包埋，切片HE染色。结果发现：Andro实验组与对照组相比，治疗组肾小囊结构恢复正常，肾小球细胞的细胞核排列规则，提示Andro能显著改善Leprdb/db小鼠肾小球系膜的扩张(图2-A)。

此外，为检测小鼠肾脏中的还原糖水平，对这3种小鼠的切片进行PAS染色(图2-B)。发现Andro 治疗后，Leprdb/db小鼠肾脏着色比对照组明显减轻(P<0.05)，与正常C57BL/6小鼠水平相近，表明Andro可以减轻肾脏还原糖累积。因此，Andro 能够改善Leprdb/db小鼠在形态学上的肾损伤，同时也能减轻Leprdb/db小鼠整个肾脏的还原糖水平(图2-B、2-C)。

A:Albuminuria levels；B:Serum creatinine；C:Blood urea nitrogen levels

*P<0.05,*P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1

Figure2 Andrographolide ameliorates glomerular pathological changes in Leprdb/dbmice

3.3 Andro对Leprdb/db小鼠肾脏中FN表达的影响

FN是ECM的主要成分，ECM的累积与糖尿病肾病的发展密切相关。本研究用免疫组化进行FN染色(图3)，发现DMSO组Leprdb/db小鼠肾FN的水平明显高于正常对照组小鼠(P<0.000 1)，而Andro治疗减少Leprdb/db小鼠肾脏中FN表达水平(P<0.001)。上述结果证明Andro可以通过减少Leprdb/db小鼠肾脏中FN的积累进而改善糖尿病肾病。

Figure3 Effect of Andro on fibronectin (FN) expression in Leprdb/dbmice kidney

3.4 Andro对Leprdb/db小鼠肾小球NOX-4水平的影响

相比C57BL/6小鼠，NOX-4在Leprdb/db小鼠肾小球系膜中的大量表达，Andro治疗减少了小鼠肾脏中NOX-4的表达水平(P<0.01)。上述结果提示，Andro可能是通过减少Leprdb/db小鼠细胞NOX-4的表达水平，进而改善糖尿病肾病中的氧化应激状态，从而改善糖尿病肾病。

Figure4 Effect of Andro on NOX-4 expression in Leprdb/dbmice kidney

4 讨 论

糖尿病肾病是糖尿病最常见的并发症之一，在我国的发病率亦呈上升趋势。20%～40%的糖尿病患者会并发糖尿病肾病，严重影响了患者的生活质量。糖尿病肾病的发病机制尚未明确，可以通过测量血尿素氮、血清肌酐、肌酐清除率和蛋白尿来诊断糖尿病肾病[22]。目前，糖尿病肾病临床常用药一般分为降糖类药物和非降糖类药物。常用的治疗糖尿病肾病的中成药有肾康注射液、黄芪注射液等[23]。黄芪注射液可以降低肾脏蛋白的排泄，具有保护肾脏的功能[24]。

Andro具有抗炎、抗肿瘤及治疗动脉粥样硬化等的作用，近年来，研究发现Andro能够改善自发免疫性糖尿病NOD小鼠的糖尿病病理进程[17-18]。Lan等[25]也报道Andro可以显著降低高糖诱导MCs细胞增殖和FN的表达，但是Andro对自发糖尿病Leprdb/db小鼠糖尿病肾病的作用尚未见研究。Leprdb/db小鼠是由美国Jackson实验室于1966年在C57BLKS/J(BKS)近交系中发现糖尿病突变基因(db)，是位于小鼠4号染色体的瘦素受体(leptin receptor)基因发生突变所致[26]。因其多饮、多食、多尿、肥胖、高血糖、高胰岛素血症等症状与人类2型糖尿病患者的临床症状相似，因此被广泛应用于糖尿病及其并发症等疾病的研究中。

本研究利用Leprdb/db小鼠研究了Andro对糖尿病肾病的作用。发现Andro可以显著降低Leprdb/db小鼠24 h尿蛋白、尿肌酐和血尿素氮的水平,显著改善了Leprdb/db小鼠肾脏代谢相关的生化指标代谢水平。另外，本研究通过观察Leprdb/db小鼠肾脏组织形态，发现Andro治疗对Leprdb/db小鼠的肾小球病理性改变有明显的改善作用，并且可以减少其肾脏的还原糖水平和ECM的累积。近年来，越来越多的研究表明，氧化应激在糖尿病肾病的发展进程中发挥着不可忽视的作用[27]。为此，本研究进一步研究发现Andro可能通过降低Leprdb/db小鼠肾脏中NOX-4表达水平以抑制肾脏细胞的氧化应激状态，进而缓解了Leprdb/db小鼠糖尿病肾病的病情。然而，Andro对Leprdb/db小鼠糖尿病肾病的具体分子机制尚需进一步研究。

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