同源结构域相互作用激酶2在恶性肿瘤中的研究进展

王建国 综述，李 一，刘锦平△ 审校

(1.遵义医学院，贵州 遵义 563003；2.四川省医学科学院·四川省人民医院乳腺外科，四川 成都 610072)

乳腺癌发病机制复杂，是一个多因素、多步骤的过程，涉及多种遗传因素、代谢风险和生活方式，但具体分子机制尚不明确。研究表明，原癌基因被激活，抑癌基因失活是乳腺癌发生的一个重要过程。近年来，同源结构域相互作用蛋白激酶2(HIPK-2)与肿瘤的关系日益受到重视，HIPK-2被认为是一种肿瘤抑制基因，在多种肿瘤的发生、发展和转移过程中发挥着重要作用；同时，HIPK-2也被认为是一种肿瘤标记物，其表达水平对指导抗肿瘤治疗有重要作用。

1 HIPK-2基本结构

HIPK-2是1998年由Kim研究组首先发现，属于同源结构域相互作用蛋白激酶家族，此家族共有4名成员，分别为HIPK-1、HIPK-2、HIPK-3以及HIPK-4。HIPK-2基因定位于人类7号染色体长臂3区3带到3区4带之间(7q33～7q34)，包含13个外显子，大小约59×103 bp[1]。HIPK2是一种定位于细胞核内的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其在各种生物体中比较保守。HIPK-2作为转录共抑制因子，包含多个功能域：一个家庭蛋白的相互作用域，一个共抑结构域，一个PEST序列，一个名叫YH域的COOH-末端和位于N端侧的蛋白激酶催化结构域[1]。

2 HIPK-2的亚细胞定位及组织分布

HIPK-2定位于核斑点，它是共阻遏物的组成部分，是包含Groucho和组蛋白脱乙酰酶的复合物[2]。HIPK-2与这些蛋白的相互作用的是通过家庭蛋白相互作用域(HID)来完成的。Pierantoni等[3]研究发现，HIPK-2在成年小鼠组织中无处不在表达，只是在不同的组织表达有所不同。HIPK-2在肌肉、心、小肠、胃、肾和脑中表达丰富，而在皮肤和肺中观察到表达水平非常低。HIPK-2普遍存在于人类成人组织中，在心脏、肌肉、肾脏中的表达比脑、白细胞、睾丸、前列腺、卵巢和小肠中表达高[4]。

3 HIPK-2在肿瘤中的作用机制研究

HIPK-2在抗癌治疗中有重要作用，它可诱导肿瘤细胞凋亡，通过激活各种下游信号通路起作用，最突出的是通过抑癌基因 p53 起作用[4]。HIPK-2失活导致p53信号传导途径功能障碍，从而诱导化疗耐药，血管生成，肿瘤生长[5]。因此，HIPK-2是一个潜在的的生物标志物和肿瘤治疗的靶标。了解HIPK-2抑癌和失活的分子机制，将会使其在肿瘤发展与转归中的作用更加清晰。

3.1HIPK-2抑制肿瘤的分子机制研究

3.1.1HIPK-2调节p53依赖的分子促进细胞凋亡

HIPK-2可以被几种类型的基因毒性损伤激活：如紫外线辐射(UV)，电离辐射(IR)和抗肿瘤药物如顺铂(CDDP)、阿霉素(ADR)等[6]。HIPK-2作为促凋亡因子(如p53)的激活剂，激活p53抑癌基因的细胞凋亡活性，从而促进细胞凋亡。① HIPK-2使p53磷酸化：HIPK-2使p53丝氨酸46(Ser46)磷酸化并允许募集组蛋白乙酰化酶(HAT)p300在赖氨酸382(Lys382)处有效的p53乙酰化[7]。这些翻译修饰后的p53能特异性诱导p53依赖性促凋亡基因转录(如p53AIP1，Noxa，Puma)，从而抑制血管生成、肿瘤生长[8]。②HIPK-2抑制Nox1活性：HIPK-2敲低有助于p53通过不同的方式失活，而不只是通过直接损害p53Ser46磷酸化。通过对siRNA沉默HIPK-2的结肠癌细胞cDNA基因芯片分析[9]，显示了Nox1上调。Nox1是超氧化物酶NADPH的同源催化亚基，通常在肿瘤中过表达并参与肿瘤进展和血管生成。HIPK-2被证明有抑制Nox1启动子活性的作用，若敲低HIPK-2，可诱导Nox1上调和Nox1过度表达，进而通过诱导p53Lys382去乙酰化来损伤p53凋亡转录活性[10]。③HIPK-2降低使金属硫蛋白2A(MT2A)表达上调：金属硫蛋白是包含至少10个富含半胱氨酸蛋白质亚型的家族，在保持基本金属的稳态中具有潜在的作用。金属硫蛋白家族(MTs)的表达上调已在乳房、结肠、肝脏和肺肿瘤中被发现，并在获得性耐药中扮演重要角色[11]。有研究发现，HIPK-2减少可导致p53蛋白质错误折叠；错误折叠后形成的p53异构体，损害了p53/DNA结合和p53转录活性[9]。这种p53错误折叠，在结肠癌和乳腺癌细胞中可能小部分归因于金属硫蛋白2A(MT2A)在HIPK-2减少后表达上调[12]。在HIPK-2敲低细胞中，可通过siRNA消除MT2A，可恢复野生型P53(wtp53)的天然构象和p53在药物反应中的功能[12]。研究发现，在大多数细胞类型中，锌通常以与MT结合的形式而存在，游离锌浓度会相当低；在异种移植的结肠癌细胞模型中，给缺乏HIPK-2的细胞补充锌剂能够恢复野生型p53(wtp53)构象和p53凋亡转录活性，从而抑制肿瘤生长[13]。④Zyxin稳定HIPK-2：在HIPK-2/p53信号轴中，响应DNA损伤反应的调节因子是域蛋白Zyxin，它是一种肌动蛋白骨架的调节因子，通过抑制Siah-1介导的HIPK-2降解来稳定HIPK-2[14]。因此，减少Zyxin，就会降低HIPK-2稳定性和抑制DNA损伤诱导的p53Ser46磷酸化和细胞凋亡。⑤HIPK-2与Axin结合：另一种在DNA损伤反应中微调p53激活阈值的分子是Axin，它使p53与Pirh2、Tip60、HIPK-2形成不同的复合物[15]。在亚致死DNA损伤时，Pirh2与HIPK-2竞争后与Axin结合，诱导的p53Ser46磷酸化。在致命的DNA损伤提示时，Pirh2-Axin失效，形成一个Axin-Tip60-HIPK2-p53复合物，其导致p53凋亡激活[15]。

3.1.2HIPK-2调节p53非依赖性的分子促进细胞凋亡 HIPK-2促进细胞凋亡的作用还可与p53无关。HIPK-2作为抗凋亡因子抑制剂，可调节抗凋亡转录因子(如抗凋亡转录共抑制因子CtBP，p53抑制剂MDM2和ΔNp63α)，促进细胞凋亡。HIPK-2参与的紫外线辐射触发CtBP清除的途径，导致细胞死亡。HIPK-2在Ser-422处磷酸化CtBP，从而诱导蛋白质降解。敲低HIPK-2，能抑制UV诱导的CtBP-Ser-422磷酸化，并使其在缺失p53的H1299肺癌细胞中降解，这证实了HIPK-2在细胞中的凋亡作用缺乏p53[16]。MDM2是p53阴性的主要调节因子，它是致癌基因，通常在肿瘤中表达上调。MDM2可根据细胞的要求微调p53介导的生物学结果(如细胞周期停滞与细胞凋亡)。然而，尽管有wtp53的存在，在过度表达MDM2的肿瘤中，p53仍然失活。因此，使用小分子MDM2抑制剂，可抑制MDM2/p53相互作用，重新激活p53和诱导肿瘤细胞凋亡[17]。此方法可阻止HIPK-2降解，并重新激活p53凋亡功能。有趣的是，锌离子治疗已被证明可恢复MDM2诱导的HIPK-2下调，通过抵消MDM2 E3泛素连接酶活性，最终重新激活HIPK-2诱导的p53Ser46磷酸化和凋亡活动[18]，但其分子机制仍需要阐明。HIPK-2的减少能诱导癌细胞即使在p53缺失时也对不同的抗癌药物耐药，这暗示HIPK-2的参与的调节路径，还有除p53以外的靶标，特别是ΔNp63α的发现[19]。它是p63的异构体，能被HIPK-2磷酸化并促进蛋白酶体降解。HIPK-2在T397残基处磷酸化ΔNp63α，但是，没有磷酸化的ΔNp63α-T397A突变体不降解，尽管有HIPK-2过度表达或ADR治疗。这些发现表明，Np63α将成为HIPK-2对遗传毒性药物反应的新靶标。

3.1.3HIPK-2防止胞质分裂中四倍体形成 最近，HIPK-2在胞质分裂中的亚细胞定位和生物学功能被证实[20]。胞质分裂中的子细胞在细胞分裂的最后一步通过收缩两个重新形成的细胞核间的细胞质间桥而分开，胞质分裂失败则可能产生四倍体细胞。四倍体细胞具有染色体不稳定的特点，最终会导致非整倍体到致瘤性的转化[21]。组蛋白H2B，在胞质分裂过程中定位于中间体的细胞间桥内。HIPK-2直接结合H2B并将其在丝氨酸残基14(Ser14)处磷酸化。尽管HIPK-2和S14磷酸化的H2B(H2B-S14P)都有凋亡功能，且这两种蛋白质共定位在中间体，但其染色体在胞质分裂过程中是独立存在的，如DNA损伤和细胞凋亡。在胞质分裂的最后一步，通过靶向基因破坏或siRNA干扰使H2BS14P在中间体中缺失，最终导致HIPK-2减少，将会诱导细胞因子依赖性畸变的积累，包括四倍体和多倍体化。值得注意的是，磷酸模拟物H2B-S14D突变体的表达可以拯救这些胞质分裂缺陷，表明HIPK-2介导的H2BS14磷酸化是细胞分裂所必需的[20]。这项研究表明HIPK-2作为肿瘤抑制因子的作用也可能是通过阻止四倍体细胞的形成来实现的，这也对理解p53通过防止倍性形成来发挥抑癌作用的机制提供了重要启示。另外，由于HIPK-2在p53促凋亡活性激活中起关键作用，如果HIPK-2失活，可能立刻产生四倍体细胞并抑制其功能。HIPK-2敲除大大降低了肿瘤细胞修复受损DNA的功能，至少部分损害了p53的功能，提示HIPK-2抑制可能增加基因组的不稳定性，从而有利于肿瘤的进展[22]。

3.2HIPK-2失活机制研究

3.2.1细胞质定位 最近的研究表明高迁移率组蛋白A1(HMGA1)与p53相互作用，抑制P53的凋亡活性。研究发现，HMGA1过度表达使HIPK-2细胞质异位，从而抑制HIPK-2/p53相互作用和凋亡激活[23]。HMGA1在肿瘤中常常过表达，并且与乳腺癌组织中野生型p53的低凋亡指数相关[23]。乳腺导管癌的免疫染色显示：HIPK-2核定位时，HMGA1低表达和高凋亡指数；HIPK-2细胞质定位时，HMGA1高表达和低凋亡指数；这意味着HIPK-2可能失活[24]。在HIPK-2细胞质定位时，乳腺癌组织中发现了整合素α(6)β(4)，其参与p53凋亡活性的损伤[24]。说明HIPK-2细胞质再定位可能是p53功能受损的一个原因。

3.2.2杂合性丢失(LOH) HIPK-2参与了p53介导的对半乳糖凝集素-3(Gal-3)的抑制。Gal-3是一种β-半乳糖苷特异性凝集素，具有抗凋亡活性，参与肿瘤发生和化疗药耐药[25]。但是，在分化良好的甲状腺癌(WDTCs)中，Gal-3高表达，尽管存在的野生型p53应该负调控Gal-3。这种情况只能解释为，在WDTC中，wtp53蛋白无活性。对冷冻甲状腺组织标本中提取的总RNA进行实时PCR和免疫组化分析显示，HIPK-2在WDTCs中的确下调[26]。在用Gal-3染色的甲状腺癌细胞中，通过激光捕获显微切割(LCM)检索，杂合性丢失(LOH)分析发现，HIPK-2 发生了遗传丢失[26]。这项研究表明HIPK-2在WDTC中表达的丧失可能是缺乏p53无活性的原因，从而解释了野生型p53存在时，Gal-3仍有过表达。另外，在小鼠中也观察到HIPK-2的 LOH。一项对辐射诱导的胸腺淋巴瘤遗传改变筛查发现，HIPK-2是一个体内肿瘤抑制基因，30%的肿瘤中缺失一个HIPK-2等位基因，这增加HIPK-2 +/-小鼠对放射诱导的胸腺淋巴瘤的易感性[27]。这项研究提供了令人信服的证据表明HIPK-2是体内响应电离辐射主要的肿瘤抑制剂，并且这个功能似乎是部分独立于p53的。

3.2.3缺氧 在实体瘤中抑制HIPK-2功能的生理条件是缺氧，这是肿瘤进展和治疗失败的一个标志。缺氧激活了缺陷型同系物-2(Siah-2)中的RING家族连接酶7，其诱导HIPK-2蛋白酶体降解[28]。缺氧的存在使得肿瘤细胞选择更恶性和侵入性的表现来对抗常规化疗和放疗，其在患者预后中起负面作用。降低缺氧利用率中的关键因子是缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)，其参与诱导血管生成，化疗耐药，葡萄糖代谢和侵袭。HIF-1由组成性表达亚基HIF-1β和HIF-1α组成，其稳定性受低氧刺激或遗传改变而改变[29]。HIPK-2已被证明能抑制HIF-1α基因转录[29]，从而对抗缺氧和恢复肿瘤细胞对化疗的敏感性，这与P53基因状态无关。有研究显示，HIF-1α过表达可诱导HIPK-2蛋白酶体降解，从而抑制p53Ser46磷酸化，最终拮抗p53介导的细胞凋亡[30]。这种新型的HIF-1α、HIPK-2和p53分子监管路径，给无功能野生型p53存在的肿瘤中，药物在缺氧条件下抑制p53的细胞凋亡作用给出了合理解释。研究发现，HIF-1α可能是锌离子诱导HIF-1α蛋白酶体降解的靶标[31]，这将开辟重新激活缺氧抑制HIPK-2/p53途径的新道路。这一发现在对缺氧处理的癌细胞中的cDNA基因芯片研究中得到了证实。研究表明锌离子确实逆转了缺氧诱导基因的转录[32]。锌离子将成为与抗癌药物组合来恢复HIPK-2/p53途径的有价值的工具。

4 HIPK-2通过Wnt/β-catenin信号通路抑制肿瘤进展

Wnt/β-catenin 信号通路被称为经典信号通路，β-连环蛋白(β-catenin)在此信号通路中扮演着极其重要的角色，是整条通路的关键枢纽分子，其在胞质中的浓度直接决定了 Wnt 信号通路的开放或关闭[9]。HIPK2 磷酸化β-catenin的Ser33和Ser37，降低β-catenin的稳定性，降低细胞核中β-catenin的量，因而能抑制β-catenin介导的细胞增殖和肿瘤形成[33]，其分子机制已明确，研究表明，HIPK-2磷酸化β-catenin以进行蛋白酶体降解，干扰了几个β-catenin靶基因的转录(如血管内皮生长因子VEGF)，从而抑制肿瘤血管生成和肿瘤生长[34]。

5 HIPK-2在相关肿瘤中的研究

对结肠癌细胞的研究显示[9]，Nox1表达上调。HIPK-2敲低，诱导Nox1上调和Nox1过度表达，进而通过诱导p53Lys382去乙酰化来损伤p53凋亡转录活性[10]，从而促进肿瘤发生与进展。在乳房、结肠、肝脏和肺肿瘤中发现，HIPK-2减少后金属硫蛋白家族(MTs)的表达上调[11]，这导致p53蛋白质错误折叠，从而损害了p53/DNA结合和p53转录活性，导致肿瘤发生。在神经母细胞瘤中，MYCN过表达。MYCN通过ATM依赖的DNA损伤反应(DDR)激活HIPK-2，再经HIPK-2/p53Ser46通路，使神经母细胞瘤细胞对细胞凋亡更敏感[35]，从而抑制肿瘤进展。一项关于皮肤癌的研究，调查了生殖器高危人乳头状瘤病毒(HPV)的致癌基因E6和HIPK-2之间的关系。研究发现，E6的β2PV类型(HPV23和HPV38)，皮肤γPV(HPV4)或生殖器HPV16，与HIPK-2相互物理作用，通过强制解离HIPK-2/p53复合物，抑制HIPK-2介导的p53Set46磷酸化[36]，从而可能有助于皮肤癌变，提示可能机制是抑制HIPK-2/p53功能。人类急性骨髓系白血病(AMLs)中发现HIPK-2核分布异常，这损害了p53细胞凋亡和转录活性[37]，也再次确认HIPK-2使p53激活而抑制肿瘤生长中的作用。在对顺铂耐药卵巢癌细胞中，外源性HIPK-2过表达能够避免细胞凋亡受抑制[38]，但其分子机制还不明确。HIPK-2在分化良好的甲状腺癌(WDTCs)中，发生杂合性丢失，导致半乳糖凝集素3(Gal-3)过度表达[26]。这项研究还表明HIPK-2在WDTC中表达的丧失可能是缺乏p53激活的原因，从而解释了存在野生型p53时，Gal-3仍有过表达。另外一篇报道称HIPK-2的高表达可能与宫颈癌的发生有关，抑制HIPK-2的表达可以抑制宫颈癌细胞凋亡，从而促进细胞生长和细胞的运动能力[39]。

6 HIPK-2在乳腺癌中的研究

HIPK-2在乳腺癌细胞中导致p53蛋白质错误折叠已如前述。另外，乳腺导管癌的免疫染色显示：HIPK-2核定位时，高迁移率组蛋白A1(HMGA1)低表达和高凋亡指数；HIPK-2细胞质定位时，HMGA1高表达和低凋亡指数；这意味着HIPK-2可能失活[23]。在HIPK-2细胞质定位时，乳腺癌组织中还发现了整合素α(6)β(4)，其参与p53凋亡活性的损伤[24]，这说明HIPK-2在乳腺癌中可能是因胞质定位而失活。Pierantoni等用RT-PCR的方法检测了20例乳腺癌的HIPK-2基因水平，发现相对正常乳腺组织，HIPK-2在乳腺癌中低表达[3]。但病例数较少，且研究者未将组织标本与临床病理资料相结合。对MDA-MB-231细胞株的体外实验研究报道称，HIPK-2可以通过下调vimentin，从而抑制乳腺癌的侵袭[40]。

综上所述，HIPK-2在遗传毒性损伤反应中诱导细胞凋亡起重要作用，深入参与了p53通过不同的机制调节蛋白质磷酸化，乙酰化和蛋白质构象。HIPK-2也可通过调节蛋白(如Nox1，MT2A，MDM2等)间接影响p53凋亡功能，使p53失调，导致肿瘤进展和化疗耐药。HIPK-2也能在p53无效的细胞中下调抗细胞凋亡分子，如CtBP和ΔNp63α，从而诱导细胞凋亡。HIPK-2可能通过几种信号传导途径参与肿瘤进展和对治疗的反应，如Wnt/β-catenin或HIF-1通路。缺氧会给HIPK-2的功能带来负面影响，从而间接影响p53的抑癌功能。HIPK-2可经历突变或杂合性丢失。HIPK-2还可以控制胞质分裂中染色体的不稳定性，从而抑制肿瘤发生。这些研究结果，展示了HIPK-2在抗肿瘤方面的重要作用，它将成为潜在的诊断标记物和治疗靶标。HIPK-2是将来很有希望的抑制肿瘤的蛋白，结合HIPK-2的抑癌机制，通过研发新的药物激活HIPK-2的功能，从而达到治疗肿瘤的目的将会是一个值得探索的领域。

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