柯里拉京通过下调NOTCH1信号通路抑制胃癌SGC-7901细胞增殖的实验研究*

尹鹏 胡君 储著凌 侯乐伟 宋博 栾荣刚 胡国强(解放军第四五四医院烧伤整形外科, 江苏 南京 210002)

大量临床研究和流行病学调查发现, 胃癌由于高幽门螺杆菌感染率、人口老龄化及食物添加剂如亚硝酸盐摄入过多等因素, 在我国仍是发病率和死亡率较高的恶性肿瘤[1-4]。根据流行病学调查数据显示每年全世界估计有90万胃癌新发病例, 同时死亡人数约为70万[1-4]。柯里拉京又称柯子次鞣素, 在老鹳草和叶下珠等中药中含量较为丰富, 作为植物多酚单宁酸类化合物具有包括抑制炎症反应、调节细胞凋亡、抑制肝脏纤维化以及抑制多种肿瘤增殖和分化等药理作用[5-7]。研究发现NOTCH1信号通路是一个高度保守的信号转导通路, 一方面参与了胚胎发育、机体生长和细胞凋亡等生理过程；另一方面, 大量研究证实NOTCH1信号通路在肿瘤的发生、转移及血管生成的调控过程中扮演了重要的角色[8-9]。目前研究证实柯里拉京可以通过调控NOTCH1信号通路抑制胆管细胞癌的增殖和分化[10]。故本研究拟观察柯里拉京对胃癌SGC-7901细胞增殖的影响及对NOTCH1信号通路的影响。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和材料 胃癌SGC-7901细胞购买于从中国科学院上海细胞库, qPCR试剂盒购自宝生物工程有限公司, 鼠抗人NOTCH1抗体、鼠抗人Hes1抗体和鼠抗人β-actin抗体购于美国Santa Cruze公司, 柯里拉京购买于美国Invitrogen公司, DMEM培养基和小牛血清均购买于杭州四季清公司, MTT试剂盒购买于美国Promega公司, 超纯水, 其余试剂均为分析纯。

1.2 细胞培养 胃癌SGC-7901细胞常规接种在含10% FBS、100g/L 青霉素、100 g/L链霉素的RPMI 1640培养液中, 置于37°C、95%空气、5 % CO2孵箱内培养。每48h换液、传代1次, 取对数生长期细胞用于实验。

1.3 细胞活性检测 取对数生长期细胞消化制成单细胞悬液, 接种于96 孔培养板中, 每孔接种100 μL约含5×103个细胞。贴壁后无血清培养细胞12～24h, 使细胞同步化。加入不同终浓度(0μg/ml、10μg/ml和100μg/ml)的柯里拉京, 在37°C, 5 % CO2条件下培养细胞, 0μg/ml的柯里拉京干预组细胞作为阴性对照组(Control组)。使用MTT比色试验对不同时间点(0、24、48 h)的细胞生长状态进行测定, 实验重复4次。对应时间点的细胞活性(%)=(OD干预组/OD对照组) × 100 (%)[11]。

1.4 qPCR法检测细胞NOTCH1和Hes1 mRNA表达水平 采用qPCR测定NOTCH1和Hes1的mRNA表达水平, β-actin为内参, 按照PCR试剂盒说明书提取总RNA。采用PrimerScript RT试剂盒进行反转录。使用iQ 5多色实时荧光定量PCR检测系统和荧光定量PCR试剂盒用于扩增, 使用β-actin作为内参照。引物和探针使用Primer Premier设计。引物序列如下: NOTCH1正义5'-GGGT CCACCAG TTTGAATGG-3', 反义5'-GTTTG CTGGCT GCAG GTTCT-3'；Hes1正义 5'-TATCATGGAG AAGAGGCGAAGG-3', 反义5'-TTCTCTAG CTTGGAATGCCGG-3'；β-actin正义: 5'-CTCCATCCT GGCCTCGCTGT-3', 反义: 5'-GCTGTCACC TTCAC CGTTCC-3'。使用2ΔΔCt法对NOTCH1和Hes1 mRNA表达水平进行测定, ΔΔCt=(Ct,目标Ct,β-actin)干预组-(Ct,目标Ct,β-actin)对照组[12]。

1.5 Western blot法检测细胞中NOTCH1和Hes1蛋白表达 按照试剂盒操作步骤, 首先提取细胞总蛋白, 并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE), 然后转移至硝酸纤维素滤膜上, 用脱脂奶粉封闭1 h, 分别加入鼠抗人单克隆抗体NOTCH1 (1: 800)、Hes1 (1: 800)和β-actin (1: 1200), 4℃孵育过夜, 洗膜后加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗(1: 2000), ECL进行显色, 采用凝胶成像分析系统进行条带灰度分析, β-actin作为内参, 使用NOTCH1/β-actin和Hes1/β-actin的比值进行比较[13]。

2 结果

2.1 不同浓度柯里拉京干预胃癌SGC-7901细胞活性比较 给予不同浓度(0μg/ml、10μg/ml和100μg/ml)的柯里拉京干预后, 使用MTT法对不同时间点(0、24、48 h)胃癌SGC-7901细胞活性进行检测。柯里拉京干预后SGC-7901细胞活性呈浓度依赖性和时间依赖性降低, 差异均有统计学意义(P<0.05), 见表1。

表1 不同浓度柯里拉京干预SGC-7901细胞活性比较Table 1 Cell viabilities of SGC-7901 cells in different time points

注: 对应时间点与0μg/ml比较， ①P<0.05；对应时间点与10μg/ml比较, ②P<0.05

2.2 SGC-7901细胞NOTCH1 mRNA和蛋白的表达 在给予SGC-7901细胞不同浓度(0μg/ml、10μg/ml和100μg/ml)柯里拉京干预48h后, 采用qPCR和western blot法对SGC-7901细胞NOTCH1 mRNA和蛋白的表达进行分析。柯里拉京干预后NOTCH1 mRNA和蛋白表达水平呈浓度依赖性下降, 差异均有统计学意义(P<0.05), 见图1、表2。

图1 SGC-7901细胞NOTCH1蛋白的表达Figure 1 The protein expression of NOTCH1 in SGC-7901 cells

Table2ThemRNAandproteinexpressionlevelsofNOTCH1andHes1inSGC-7901cells

浓度(ug/ml)NOTCH1mRNANOCTH1蛋白Hes1mRNAHes1蛋白01．000 98±0 021．000 96±0 04100 71±0 12①0 66±0 15①0 53±0 17①0 61±0 13①1000 31±0 07①②0 24±0 06①②0 23±0 05①②0 26±0 07①②

注: 与0μg/ml相比较, ①P<0.05； 与10μg/ml相比较, ②P<0.05

2.3 Hes1 mRNA和蛋白的表达 在给予SGC-7901细胞不同浓度(0μg/ml、10μg/ml和100μg/ml)柯里拉京干预48h后, 采用qPCR和western blot法对SGC-7901细胞Hes1 mRNA和蛋白的表达进行分析。柯里拉京干预后Hes1 mRNA和蛋白表达水平呈浓度依赖性降低, 差异均具有统计学意义(均P<0.05), 见图2、表2。

图2 SGC-7901细胞Hes1蛋白的表达Figure 2 The protein expression of Hes1 in SGC-7901 cells

3 讨论

胃癌是全球发病率最高的恶性肿瘤之一, 研究表明在成年人中胃癌已成为中国发病率第二的恶性肿瘤, 同时也是导致我国成人因恶性肿瘤死亡的第三大原因[1-4, 14-15]。在全球范围内东亚地区的胃癌发病率最高, 患病人数超过全球总患病人数的一半[1-4, 14]。大量研究发现胃癌的发病与基因突变、幽门螺杆菌感染(helicobacterpyloriinfection)、饮食结构、人口老龄化及食物添加剂如亚硝酸盐摄人过多等因素密切相关[1-4, 14]。因此寻求新的治疗药物和方法对于临床治疗胃癌将会有重要的价值和意义。

柯里拉京是中草药老鹳草和叶下珠的主要药理成分, 其属于酚单宁酸类化合物。有研究表明柯里拉京对于炎症反应、细胞凋亡、肿瘤的分化和增殖、氧化应激等病理和生理过程均有调控作用, 同时研究还发现柯里拉京具有抑制细菌和病毒等病原体生长的药理作用[5-7, 16]。Gu Y等的研究证实柯里拉京可有效抑制胆管细胞癌细胞的增殖和分化并可促进肿瘤的凋亡[16]。Jia L等的研究还发现柯里拉京对卵巢癌SKOv3ip细胞和Hey细胞的增殖有明显的抑制作用。本研究结果表明柯里拉京对胃癌SGC-7901细胞的增殖和分化有显著的抑制作用。

NOTCH1基因及其信号通路在进化上及其保守, 广泛存在于低等和高等动物体内。研究发现NOTCH1信号通路在生长发育、细胞凋亡、炎症反应的调控、肿瘤的转移、分化和血管生成以及器官纤维化等生理和病理过程中扮演着重要的角色[8-9, 18-20]。Sawaguchi S等[18]人的研究发现NOTCH1信号通路对于血管内皮细胞的增殖以及血管再生的出芽过程有重要的调控作用。Zhou Y等[19]人发现黄芪注射液(Astragalus injection)可以通过下调Jagged1/Notch1信号通路减轻博莱霉素(bleomycin)诱导的大鼠肺纤维化。Li Y等的研究证实miR-375、miR-30a和miR-34a可以通过Presenilin/Notch1信号通路调控高糖诱导的胰腺β细胞的凋亡[20]。我们前期的研究也发现γ-分泌酶抑制剂DAPT对结肠癌HCT116细胞增殖的抑制作用与调控NOTCH1/Hes1信号系统明确相关[8]。实验证实Hes1是NOTCH1信号通路重要的下游分子, Hes1作为信号通路中间分子对于下游的NF-κB和SOX2等转录因子的表达有关键的调控作用[21-22]。Batchuluun K等[21]的研究显示在大鼠垂体细胞中NOTCH1/Hes1信号通路对于转录因子SOX2的合成有关键的调控价值。Zhang Q等[22]的研究证实在脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞株RAW264.7细胞中NOTCH1/Hes1信号通路对于NF-κB的活化具有重要的调控作用。本研究中我们发现在给予胃癌SGC-7901细胞柯里拉京干预后NOTCH1 和Hes1 mRNA和蛋白表达水平均呈浓度依赖性降低, 差异均存在明显统计学意义(P均<0.05)。该结果提示柯里拉京对胃癌SGC-7901细胞NOTCH1和Hes1基因的表达有显著的抑制作用。

4 结论

柯里拉京可通过下调NOTCH1/Hes1信号通路抑制胃癌SGC-7901细胞增殖, 同时为柯里拉京应用于临床治疗胃癌等恶性肿瘤奠定了实验基础。

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