鲍温病及佩吉特病患者皮损中GRIM 19表达水平的研究*

刘随 刘斌 金汶 徐倩倩(湖北省药学院附属随州医院皮肤科, 湖北 随州 441300)

鲍温病是一种常见的原位皮肤鳞状细胞癌, 常发生于老年人, 临床上主要表现为皮肤表面出现边缘不规则的褐色斑块, 斑块上方会有少量的鳞屑, 其发病原因有与长期暴露在紫外线、接触某些化学试剂(如砷)、人类乳头状病毒的感染以及某些疾病(如着色干皮病、疣状角化不良病)有关, 目前手术切除是治疗鲍温病的最有效治疗方式[1-3]。佩吉特病分为乳腺佩吉特病和乳腺外佩吉特病, 该病具有易转移浸润, 易引发乳腺癌，乳腺外佩吉特病易引发泌尿生殖道或消化道癌、病程长等特点；手术切除是该病早期的主要治疗方式[4-5]。尽管鲍温病和佩吉特病在临床上困扰患者多年, 但是它们的发病具体机制尚不清楚。干扰素与维甲酸联合应用诱导细胞凋亡相关基因 19(GRIM 19)是一种与肿瘤细胞的生长有关的抑癌基因, 其能够参与调控癌细胞的迁移、浸润及生长, 近些年成为肿瘤领域的研究热点[6-7]。此外, 研究发现GRIM 19在部分癌细胞中表达水平显著下降[8]。GRIM 19与鲍温病和佩吉特病之间是否有关系尚不得知, 本研究通过检测鲍温病和佩吉特病患者皮损部位GRIM 19水平, 探究GRIM 19与鲍温病和佩吉特病之间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 随机选取2015年7月～2016年7我院诊疗的鲍温病和佩吉特病患者共70例。其中鲍温病患者37例, 其中男性14例, 女性23例, 平均年龄(57.1±8.9)岁, 患者患病区域分别在四肢(上肢患病13例, 男性4例, 女性9例；下肢患病12例, 男性4例, 女性8例)和躯干(12例, 男性6例, 女性6例)；佩吉特病患者33例, 其中男性8例, 女性25例, 平均年龄(59.1±9.7)岁, 其中乳腺佩吉特病17例(患病位置均是乳房区域, 患者均为女性), 乳腺外佩吉特病16例(患病区域在腋窝5例, 男性2例, 女性3例；患病区域在腹股沟6例, 其中男性3例, 女性3例；患病区域在外耳道5例, 其中男性3例, 女性2例)。健康正常人34例, 其中男性13例, 女性21例, 平均年龄(58.7±8.3)岁, 均自愿参与该研究。鲍温病患者的年龄、性别和佩吉特病患者的年龄、性别分别与健康正常人的年龄、性别之间无显著性差异。纳入标准: ①符合鲍温病和佩吉特病的诊断标准。②血常规、肝、肾功能正常。③自愿接受样本采集。排除标准：①不符合本病诊断标准的患者。②接受过化疗的患者。③癌细胞转移或复发者。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 鲍温病和佩吉特病患者皮损组织样本由本科室临床医生采集, 采集后的皮损组织部分置于4%多聚甲醛固定, 用于免疫组化检测, 剩余部分皮损组织置于液氮保存, 用于Real-time PCR检测。根据患者的患病区域, 在本单位皮肤整形科室尽可能收集与每个患者患病区域对应的健康人皮肤组织(通过检测收集到不同部位健康皮肤组织中的GRIM 19表达水平, 我们发现皮肤组织GRIM 19表达水平无显著的区域差异性), 这些皮肤组织部分置于4%多聚甲醛固定, 用于免疫组化检测, 剩余部分皮肤组织置于液氮保存, 用于Real-time PCR检测。

1.2.2 Real-time PCR检测 将健康皮肤及皮损组织研磨, 应用Trizol法提取皮肤组织的总RNA, 以总RNA为模板, Oligo(dT)18为引物反转录合成cDNA, 选用在皮肤组织中稳定表达的β-actin 作为内参, 应用Real-time PCR 测定健康皮肤及皮损组织GRIM 19 mRNA表达水平, GRIM 19上游引物: 5'-CACGGATCGTCCACAGCCC-3', 下游引物: 5'-TCAGGACAATCGTGGACAC-3'；β-actin上游引物: 5'-ACATCTGCTGAAGGTGGAC-3', 下游引物: 5'-GGTACCACCATACCAGG-3'。

1.2.3 免疫组化 取4%多聚甲醛固定的健康皮肤组织及皮损组织, 经脱水、石蜡包埋、切片、脱蜡、抗原修复步骤后, 与兔抗人GRIM 19抗体(购于CST公司)在37℃下孵育1 h, TBS洗涤3次后, 与羊抗兔抗体于37℃下孵育1 h, TBS洗涤3次后, 采用DAB显色, 在显微镜下拍摄结果, 被染成黄色或棕黄色者为阳性。并采用图像分析软件ImagePro Plus分析各样本阳性表达强度。

2 结果

2.1 鲍温病及佩吉特病患者皮损组织GRIM 19 mRNA表达水平的变化 Real-time PCR结果表明, 鲍温病与佩吉特病患者皮损组织中GRIM 19 mRNA表达水平相比于健康人皮肤组织, 显著下降(P<0.05), 见图1。

图1鲍温病及佩吉特病皮损组织GRIM19mRNA表达水平与健康人皮肤组织对比

Figure1GRIM19mRNAexpressionsofkinlesionofpatientswithBowen'sdiseaseandPaget'sdiseaseandhealthypeople

注: A: 鲍温病VS健康人①P<0.05；B: 佩吉特病VS健康人, ②P<0.01

2.2 鲍温病及佩吉特病患者皮损组织GRIM 19 蛋白表达水平的变化 免疫组化结果表明, 鲍温病及佩吉特病患者皮损组织中GRIM 19 蛋白表达水平相比于健康人皮肤组织显著下降, 结果见图2、图3、图4。

图2鲍温病及佩吉特病皮损组织GRIM19蛋白表达水平与健康人皮肤组织对比

Figure2GRIM19proteinexpressionsofkinlesionofpatientswithBowen'sdiseaseandPaget'sdiseaseandhealthypeople

注: A: 鲍温病VS健康人, ①P<0.05；B: 佩吉特病VS健康人, ②P<0.01

图3鲍温病患者皮损组织及健康人皮肤组织中GRIM19免疫组化结果
Figure3TheimmunohistochemicalresultsofGRIM19inkinlesionofpatientswithBowen'sdiseaseandhealthypeople

图4 佩吉特病患者皮损组织及健康人相应皮肤组织中GRIM 19免疫组化结果Figure 4 The immunohistochemical results of GRIM 19 in kin lesion of patients with Paget's disease and healthy people

3 讨论

GRIM 19最早是由美国马里兰州大学肿瘤中心研究人员于2000年发现, 主要存在于线粒体内膜上, 能够参与构成线粒体复合体I[9]。随着研究深入, GRIM 19近年被公认为一种抑癌基因[10]。GRIM 19诱导细胞凋亡的机制比较复杂, 但研究表明其发挥功能主要是通过调节线粒体内呼吸链。复合体I是线粒体内主要呼吸链的重要组成成分, 而GRIM 19是复合体I的功能单位, 其通过调节线粒体内的呼吸链活动, 进而影响细胞内的能量产生, 当细胞生长异常时, GRIM 19通过抑制细胞内呼吸链呼吸强度, 进而诱导细胞的凋亡[8, 11]。除了通过调节细胞呼吸链调节细胞生存状态, 研究还发现GRIM 19可以通过调节STAT3, 进而促进癌细胞的凋亡[12-13]。体外实验发现, 当癌细胞表达的GRIM 19水平升高后, GRIM 19结合的STAT3含量也相应增多, 而癌细胞的增殖转移能力受到显著的抑制[14]。

GRIM 19在人体组织器官中普遍表达, 且在心脏及骨骼肌中表达量较高[15]。但是研究发现, GRIM 19在肺癌、肝癌、宫颈癌、乳腺癌、胃癌、食管癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌、神经胶质瘤以及甲状腺Hurthle细胞肿瘤组织中表达水平显著下降, 且GRIM 19表达水平与肺癌的临床分期呈负相关；GRIM 19在肝癌及乳腺癌细胞中的水平与肝癌细胞转移、浸润能力有关；GRIM 19在宫颈癌、食管癌、前列腺癌、卵巢癌等肿瘤细胞中的水平与肿瘤的恶性程度以及预后有关系[15-17]。因此, 通过研究肿瘤GRIM 19有利于肿瘤细胞的诊断分型、预后等, 且GRIM 19能够作为治疗这些肿瘤的新靶点。鲍温病及佩吉特病是常见的皮肤肿瘤疾病, 手术时治疗该类疾病的主要方式, 目前关于鲍温病及佩吉特病发病机制及治疗靶点的研究尚不足。本研究发现, 健康人皮肤组织表皮基底层细胞高表达GRIM 19, 而鲍温病及佩吉特病患者皮损癌组织中GRIM 19表达水平显著低于健康人皮肤组织水平。而GRIM 19作为一个细胞凋亡调控因子, 可特异性地与信号传导与转录激活因子3(STAT3)结合, 阻断细胞质内的STAT3进入细胞核, 通过下调STAT3的转录激活活性, 抑制其靶基因的表达, 继而控制细胞的生长[18-19]。故鲍温病及佩吉特病的发生、发展可能干扰了GRIM 19的正常表达, 致使该因子对细胞生长的调控作用失效, 最终导致细胞恶性增殖的发生。而GRIM 19是否是鲍温病及佩吉特病发生、发展过程中的关键分子需要进一步实验去确定。

4 结论

本文资料显示，GRIM 19与鲍温病及佩吉特病存在相关性, 提示GRIM 19可能在鲍温病及佩吉特病发病过程中扮演重要角色, 为鲍温病及佩吉特病临床诊断分型及发病机制的研究提供了理论基础。

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