血液系统条件性DNMT3B基因敲除小鼠的构建及鉴定*

李福兴，胡超，何薇，乔晓红，谢晓恬

（1.同济大学附属同济医院 儿科，上海 200065；2.复旦大学附属中山医院泌尿外科，上海 200032）

抑癌基因失活可导致肿瘤的发生，而启动子区高甲基化是导致抑癌基因沉默失活的常见机制之一，该现象广泛地存在于多种恶性肿瘤中[1]。DNA甲基化是表观遗传学中一种最为重要的修饰，是通过DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）来催化和维持。DNMTs包括 DNMT1，DNMT2，DNMT3A，DNMT3B，后2个在哺乳动物DNA甲基化中起主要催化作用[2]。目前研究发现，DNMT3B在部分MDS及急性髓系白血病中呈高表达水平，且高表达患者生存期较短，化疗疗效不佳，预后不良，提示DNMT3B在血液肿瘤疾病发生、发展起重要作用[3-6]。通过基因敲除是研究基因功能的主要手段之一，目前国内尚无在血液系统条件性敲出DNMT3B基因小鼠模型的报道，国外仅有利用Cre/loxP系统在细胞水平敲出DNMT3B基因的研究[7]，也有可以在肠道组织敲除DNMT3B小鼠模型相关研究[8]，尚无可以条件性在血液系统敲出DNMT3B基因小鼠模型的报道。本课题组利用引进的DNMT3Bflox/flox小鼠，与Mx1-Cre小鼠交配，成功构建可以在血液系统条件性敲除DNMT3B基因的小鼠，并进行敲除后鉴定，为研究DNMT3B在血液肿瘤中的作用提供动物模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物

DNMT3Bflox/flox小鼠 [从 Fan Guoping教授（David Geffen School of Medicine，UCLA）获得 ]，Mx1-Cre小鼠（由伊利诺伊大学芝加哥校区血液肿瘤研究实验室保存繁育），均为C57BL/6背景。所有动物饲养繁殖均在伊利诺伊大学芝加哥校区实验动物中心完成。

1.2 小鼠饲养和繁殖

按照SPF级动物饲养标准进行饲养，环境温度控制在20～25℃，湿度控制在40%～70%，小鼠饲料、垫料和饮水均经过高温高压灭菌处理，垫料1周更换1次。采用1只雄鼠和2只雌鼠同居的方式进行繁殖。母鼠孕期为19～21 d，哺乳期为20～22 d。

1.3 方法

1.3.1 小鼠构建策略与流程 DNMT3Bflox/flox小鼠，是以DNMT3B基因的16～19号外显子作为靶基因，在其两端插入loxP位点（见图1A），与表达Cre酶的Mx1-Cre工具鼠（见图1B）交配后获得DNMT3Bflox/floxMx1-Cre+，通过注射pI-pC注射诱导Cre重组酶表达，切除2个LoxP位点间的序列，从而实现靶基因的敲除。

1.3.2 构建流程 DNMT3Bflox/flox小鼠与Mx1-Cre+小鼠交配后产生DNMT3Bflox/+Mx1-Cre+及DNMT3Bflox/+Mx1-Cre-2种子代，再用DNMT3Bflox/+Mx1-Cre-与DNMT3Bflox/+Mx1-Cre+杂交产生子代，最后通过PCR反应鉴定其基因型（见图1C）。

图1 DNMT3B敲除小鼠模型构建流程

1.3.3 小鼠基因型鉴定 剪取4周龄小鼠尾尖2～5 mm，置于1.5 ml Eppendorf管中，每管加入鼠尾裂解缓冲液（direct PCR lysis reagent，Viagen Biotech Inc）100 μl和 蛋 白 酶 K（proteinase K，Sigma-Aldrich）5 μl，55℃震荡裂解过夜；然后85℃，45 min灭活蛋白酶K；室温，12 000 r/min离心，5 min，取上清做模板可用于PCR分析。使用Sigma公司合成的引物进行聚合酶链反应（PCR）。见表1。

反应体系（10 μl）：10×Titanium Taq Buffer 1 μl，模板 DNA 1 μl，正反向引物各 0.1 μl，50×Titanium Taq Polymerase 0.2 μl，4 μmol/L dNTP 0.5 μl，双蒸水补足至10 μl。反应条件为95℃预变性1 min；95℃变性30 s、63℃退火30 s、72℃延伸30 s，33个循环；最后72℃延伸7 min，置入4℃保存备用，取PCR反应终产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，根据扩增条带确定小鼠子代基因型。

表1 基因型鉴定的引物

使用Floxed引物扩增，凡是能扩增出2条带（270和406 bp）者均为DNMT3Bflox/+，而只能扩增出1条406 bp条带者基因型必为DNMT3Bflox/floxMx1-Cre+或者DNMT3Bflox/floxMx1-Cre-；再以Cre通用异物扩增，凡是可以扩增出301 bp条带者为DNMT3Bflox/floxMx1-Cre+，即可以用于DNMT3B敲除的小鼠，见表2。

表2 基因型对应电泳条带

1.3.4 转基因小鼠DNMT3B敲除效能鉴定 由于floxed小鼠在DNMT3B基因的15和16，19和20号外显子中间各插入1个LoxP位点，设计敲除后鉴定引物primer F’，位于15号外显子，如果成功敲除，将可以扩增出500 bp左右条带。对DNMT3Bflox/floxMx1-Cre+小鼠，通过隔天腹腔注射聚肌胞苷酸（pI-pC；GE Healthcare）1次，体重10 μg/g，共5次，诱导DNMT3B基因的丢失。pI-pC腹腔注射完成后，第7天处死小鼠取骨髓细胞，使用DNA提取试剂盒（Puregene Blood Core KitB，QIAGEN）按说明书提取DNA，同时使用3条引物primer F，primer F’，primer R按genotyping体系和条件行PCR证实DNMT3B的敲除。

2 结果

2.1 DNMT3Bflox/flox Mx1-Cre+小鼠鉴定

通过DNMT3Bflox/+Mx1-Cre+和DNMT3Bflox/+Mx1-Cre-交配，共产出小鼠13只，分两步分别进行DNMT3Bflox/flox和Mx1-Cre基因型鉴定。

2.1.1 DNMT3Bflox/flox基因型鉴定 DNMT3Bflox/+小鼠自交所生子代DNMT3Bflox/flox、DNMT3Bflox/+、DNMT3B+/+的基因型鉴定结果，见图2：仅可以扩增出270 bp条带的为野生型（如2号和10号），可以同时扩增储270和406 bp的为杂合子（如1，3，6，11，13号），而仅可以扩增出406 bp条带者为DNMT3Bflox/flox，需要的突变纯合子（如4，5，7，8，9，12号）。

图2 DNMT3Bflox/flox基因型PCR鉴定结果

2.1.2 Mx1-Cre基因型鉴定 Mx1-Cre+及Mx1-Cre-小鼠交配仅可以产出Mx1-Cre+和Mx1-Cre-两种子代，其中基因型为Mx1-Cre+的子代可以扩增出301 bp条带（如9和12号），而基因型为Mx1-Cre-的子代无法扩增出条带（如1-8号，10号和13号），在获得的13只子代小鼠中，只有9号和12号携带Mx1-Cre基因。见图3。

图3 Mx1-Cre基因型PCR鉴定结果

2.1.3 DNMT3Bflox/floxMx1-Cre+个体获得 综合分析DNMT3Bflox/flox基因型和Mx1-Cre基因型鉴定结果，确认9号和12号子鼠基因型为DNMT3Bflox/floxMx1-Cre+，是可以用于敲除DNMT3B的工具鼠。

2.2 Dnmt3B敲除鉴定

对DNMT3Bflox/floxMx1-Cre+小鼠，隔天注射5次pI-pC后，取鼠尾组织行PCR进行基因型鉴定，由于可以敲除DNMT3B基因，故能扩增出500 bp的片段，用作实验组对象。而DNMT3Bflox/floxMx1-Cre-小鼠无法敲除DNMT3B基因，只能扩增出406 bp的片段，可用作对照组。见图4。

图4 DNMT3B敲除后PCR鉴定结果

3 讨论

在哺乳动物基因组中，CpG岛甲基化是最常见的表观遗传学修饰，不仅对个体正常发育起重要作用，还可以影响基因表达、染色体结构和稳定性[9]。甲基化调控需要DNMTs的参与，其中DNMT3A和DNMT3B负责从头甲基化，影响DNA的甲基化水平并调节基因表达[10]。R OBERTSON等研究发现，恶性肿瘤患者DNMT3A、DNMT1及DNMT3B表达上调，且DNMT3B的表达水平升高最为显著[11]，提示DNMT3B可能在恶性肿瘤发病中起重要作用。随着研究的深入发现，DNMT3B基因高表达与膀胱癌，胃肠道恶性肿瘤，乳腺癌、肝癌及白血病等多种恶性肿瘤发生、发展关系密切[12-15]，目前认为，DNMT3B可以导致抑癌基因启动子CpG岛高甲基化，导致基因表达沉默，从而导致肿瘤的发生[16-17]。有研究提示，DNMT3B在myc诱发的淋巴瘤和MLL-AF9诱发的AML中表现为抑制肿瘤作用，提示其抑癌基因属性[18]，然而亦有研究显示在AML患者中，DNMT3B高表达与不良预后有关[19]，提示原癌基因属性，故DNMT3B在血液肿瘤中的作用和机制有待进一步研究。

构建基因敲除小鼠模型，在全部组织或者特定组织中使某基因功能缺失，是阐明该基因功能最直接有效的手段之一。Cre/LoxP重组酶系统是目前用于条件性基因敲除中最常用的系统工具之一。LoxP序列来源于噬菌体P1，而Cre酶是来源于噬菌体P1的一种蛋白。LoxP序列中的特殊回文结构可以被Cre酶特异性识别结合并催化2个LoxP序列之间的片段发生同源重组，进而实现对该片段的基因敲除。如果将Cre重组酶cDNA通过基因工程的手段置于组织或细胞特异性启动子之下，可以实现在特定组织/细胞特异性表达Cre，获得Cre工具小鼠跟Flox小鼠交配之后，可以得到可以在特定组织细胞中进行基因敲除的小鼠[20]。

本研究为构建DNMT3B基因条件性敲除小鼠，首先从美国实验室引进DNMT3Bflox/flox小鼠，该小鼠在DNMT3B基因的15和16，19和20号外显子中间各插入1个LoxP位点[21]。通过与血液系统特异表达Cre酶的Mx1-Cre小鼠杂交，获得DNMT3Bflox/floxMx1-Cre+小鼠，用pI-pC诱导Cre酶表达，可以在血液系统敲除DNMT3B核心序列，使得靶基因不能正常转录表达。DNMT3Bflox/floxMx1-Cre+小鼠模型的构建为研究DNMT3B在正常造血调控及血液肿瘤中的作用机制提供合适的工具。基于Cre/LoxP系统，开发构建其他组织系统特异性CRE表达小鼠，可以通过条件敲除DNMT3B研究其在多种肿瘤中的作用机制。

志谢：感谢UCLA范国平教授慷慨提供DNMT3Bflox/flox小鼠，感谢伊利诺伊大学芝加哥分校钱志坚教授提供Mx1-cre小鼠及实验指导，感谢黎力平博士对实验操作技术指导。

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