利用分子信标和EXO III放大荧光信号快速检测Ag+

贺气志,罗怀青,陈珂珂,徐 倩,唐 亮,宁 毅 (.长沙医学院基础医学院,湖南 长沙 4029；2.湖南中医药大学医学院,湖南 长沙 40208)

核酸适配体因与金属离子结合具有很高的特异性,已被应用于新型传感器的开发.已有报道Ag+能够特异性的与2个胞嘧啶(C)结合形成C-Ag+-C复合物,富含C的核酸适配体在Ag+存在时能通过自由链形成稳定的发卡结构,基于此已发展一些具有高度选择性的生物传感器用于检测Ag+[10-12].尽管核酸适配体探针的特异性很强,但是俘获靶标量不大,导致灵敏度不高.

近年来,信号放大技术已逐步被应用于高灵敏度临床检测、基因治疗和环境监测等领域[13-14].通常通过纳米材料和分子生物学技术放大信号,如链替代扩增反应[15]、连接酶链反应[16]、靶标循环[17]等.其中基于酶切靶标循环的信号放大技术,被认为是信号放大的非常有效的方法[18].

核酸外切酶是一类能够从一端开始顺次水解磷酸二酯键的核酸酶,其产物为单个核苷酸,广泛应用于传感器设计.核酸外切酶III(EXO III)作用于双链DNA,沿3’→5’方向逐步切去单个核苷酸,无碱基特异性,但是不能从3’端突起的核酸链开始降解.最近有报道利用EXO III的水解特性放大信号用于检测DNA[19-21].由于荧光分析法具有灵敏度高,操作简便等优点,广泛应用于环境污染物检测[7,9,22].然而,到目前为止还没有基于荧光能量共振转移(FRET)原理将分子信标与EXO III结合起来用于检测重金属离子的研究.

本研究设计荧光分子(FAM))和淬灭基团(BHQ)标记的分子信标,利用Ag+核酸适配体的高度特异性并结合EXO III的酶切特性有效放大荧光检测信号构建灵敏度高、特异性强、成本低的快速检测Ag+的生物传感器,为Ag+的检测提供新的方法.

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

本研究所用的DNA全部购自上海生工生物有限公司,如表1所示.EXO III购买于MBI公司.

表1 设计的核苷酸序列Table 1 Oligonucleotides designed in this study

所有化学试剂均购自于国药集团,纯度为分析纯.将AgNO3溶解于超纯水制备所需Ag+浓度.0.02μm滤膜,Milli-Q型纯水仪(Millipore,美国),LS55型荧光分光光度计(PerkinElmer,美国),PL203型电子天平(梅特勒一托利多公司,瑞士),DELTA-320pH计(梅特勒,瑞士).

1.2 检测条件的优化

反应体系的pH值和酶切时间是影响该方法检测效率以及灵敏性的重要因素,因此对这2个条件进行了优化.将Tris-HCl反应体系的pH值分别设定6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8六种不同梯度.分别在不同pH值反应体系中将浓度200nmol/LAg+与探针、分子信标室温孵育50min,让其充分结合,然后加入EXO III,45min后测定体系的荧光值.此外,将浓度为200nmol/LAg+与探针、分子信标室温孵育50min,让其充分结合,然后加入EXO III,每5min测定体系的荧光值,对照组Ag+浓度为0,方法同靶标组.本研究所有实验均重复3次,取其平均值.

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1.3 灵敏度分析

设定Ag+浓度为0, 0.1, 0.5, 1, 20, 60, 100,150, 200, 300nmol/L,分别加入到探针DNA和分子信标混合液中室温孵育50min,使靶标、探针、分子信标充分结合形成特定的空间结构.然后加入2U的EXO III,室温孵育50min,在激发波长495nm,发射波长530nm 下测定体系的荧光值.该反应体系用Tris-HCl(pH7.4)定容至100μL,探针DNA终浓度为50nmol/L,分子信标终浓度为200nmol/L.本研究所有实验均重复3次,取其平均值.

1.4 特异性分析

为考察该体系的特异,以Ag+为实验组,以Mn2+、Pb2+、Cu2+、Cd2+、Zn2+、Ca2+、Fe3+为对照组,所有离子浓度均为100nmol/L,按上述方法测定该体系的荧光值.为了进一步验证体系的抗干扰能力,将上述7种非靶标金属离子各2μmol/L与200nmol/L Ag+一同加入体系反应后,在激发波长495nm,发射波长530nm下测定荧光值.

1.5 对实际样品中Ag+的检测

为考察该方法对实际样品中Ag+检测能力,对湘江水进行检测.因考虑到湘江水含有其他基质,首先用滤纸进行过滤去除大颗粒物质,再用0.02μm的超滤膜对其进行过滤,再将pH值调整至7.4[7].将不同浓度梯度的Ag+加入体系,体系中溶液为体积比1:1的湘江水与Tris-HCl (pH7.4),反应后在激发波长495nm,发射波长530nm下测定荧光值.

2 结果与分析

2.1 生物传感器的设计原理

设计新型DNA探针,包含中间核酸适配体序列和两端的与分子信标互补序列.当体系中不存在Ag+时,分子信标与DNA探针在反应液中互不干扰,处于游离状态,分子信标两端的荧光分子和淬灭分子由于距离太近发生能量共振转移,荧光被猝灭;当向体系中加入Ag+时,DNA探针的核酸适配体部分与靶标结合形成发卡结构[12],探针的两端序列则会拼接起来与分子信标形成互补的双链.加入EXO III后,由于DNA探针3’端的4个碱基被硫代处理从而能防止其被EXO III酶解[20],因此,EXO III将从分子信标的3’端依次降解核酸,使得荧光分子FAM远离BHQ而被释放到溶液中,体系荧光值增大.而靶标与探针DNA结合的复合物则能与分子信标结合继续下一个循环反应,产生更多游离的荧光分子,体系的荧光信号被不断放大,如图1所示.分子信标能与探针的两端拼接互补形成双链是本体系的关键所在.如果DNA探针适配体区域与分子信标互补区域间隔的碱基数过多,将会导致拼接排列不紧密而影响分子信标和探针的结合效率;如果间隔的碱基数太少,由于碱基与碱基之间的空间位阻将会阻碍分子信标与探针的结合.因此设计间隔碱基数分别为0,1,2,3,4 bp的5种探针,分别比较5种探针检测相同浓度的Ag+(200nmol/L)得到的信噪比,如图2所示.P3间隔2个碱基所产生的信噪比最大,说明这种探针与分子信标的结合效果最好,后续实验均采用此探针.P1信噪比接近1,说明间隔太短,由于空间位阻,分子信标基本不能与探针拼接形成双链.P5信噪比高于1但是低于P3,说明间隔太长,分子信标与探针的结合效率不理想.

图1 基于分子信标和EXO III活性放大信号对Ag+检测的原理示意Fig.1 Schematic diagram for detection of Ag+ based on molecular beacon and signal amplification assisted by EXO III

图2 DNA分子探针的优化Fig.2 The optimization of DNA probe

2.2 检测条件的优化

图3 检测体系pH值和酶切时间的优化Fig.3 The optimization of pH and digestion time of the reaction system

反应体系在不同的pH值条件下,其检测的荧光效率表现不同,如图3(a)所示.pH值为7.4时,体系的荧光值达到最大,因此可以确定7.4为该体系的最佳pH值,后续所有实验均采用此值.分子信标与探针互补配对后,在EXO III的作用下降解分子信标,释放游离的FAM,体系荧光值增强.但如果酶切时间不够,分子信标将无法完全被酶解从而释放游离的FAM,同时Ag+/DNA探针复合物也无法释放用于下一轮循环反应,这将会极大的影响检测体系的荧光效率和灵敏度.因此,为达到最佳的检测效果和检测效率,探索酶切的最佳反应时间.如图3(b)所示,5～50min内随着酶切时间延长,荧光值的增加与时间成直线关系,50min后体系荧光值几乎不再改变,结果表明FAM已完全释放出来,此时的荧光效率最佳,因此我们选50min为最佳酶切时间.

2.3 灵敏度分析

图4 Ag+的灵敏性分析Fig.4 The sensitivity analysis of the method for Ag+

为考察该检测体系的灵敏度,将不同浓度梯度的Ag+分别加入到检测体系中,记录荧光值.如图4,随着Ag+浓度的增加, Ag+将与DNA探针形成C-Ag+-C复合物,探针形成发卡结构,使得两端序列拼接起来与分子信标互补形成双链,在EXO III的作用下,分子信标水解释放游离FAM,同时探针与Ag+形成的发卡结构可以进入下一个循环与分子信标结合,产生更多游离的FAM,荧光强度不断增加.当Ag+浓度大于200nmol/L时,荧光强度增加不显著,说明Ag+与DNA探针结合已达饱和并形成稳定的杂交结构,导致分子信标被完全酶解,FAM完全释放.该检测体系在Ag+浓度为0.5～200nmol/L范围内,荧光值与靶标浓度成线性关系(Y=0.950X+87.55,R2=0.994). Ag+浓度为0.1nmol/L的荧光品均值与背景信号的比值为3.05,即信噪比大于3具有检测意义,因此其检测下限(LOD)可达0.1nmol/L.该检测体系比Xu等[10]构建的超敏电化学传感器操作简便,价格低廉.其LOD低于已报道的Wen等[23]构建基于石墨烯传感器(1.0nmol/L)、Wei等[7]构建的Dnase I介导的纳米石墨传感器(0.3nmol/L).检测体系的高灵敏度表明其具有实际应用前景.

2.4 特异性分析

图5 Ag+的特异性分析Fig.5 The specificity analysis of the method for Ag+

在特异性分析中,将相同浓度的靶标离子与其他金属离子加入反应体系中,在相同条件下反应后测定荧光值.如图5所示,靶标离子的荧光值要远大于其他非靶标金属离子的荧光值,极易区分靶标离子和非靶标离子,因此具有很强的特异性.该体系的高度特异性归功于DNA探针与Ag+形成C-Ag+-C复合物的特异性和亲和力.进一步考察该体系检测时的抗干扰能力,将其他非靶标金属离子和靶标离子混合测定其荧光值,如图6所示.其他金属和靶标离子混合物的荧光值(曲线1)远大于其他金属混合液(曲线2),并且背景信号低(曲线3).结果表明,该方法检测靶标的

荧光值与其他混合金属的荧光值比值为5.5,即信噪比大于3,具有检测意义因此具有高度的选择性,并且在复杂体系中具有很强的抗干扰能力,优于已报道的电化学传感器,碳纳米传感器等[5,7,23].

图6 抗干扰能力分析Fig.6 Analysis of the Anti-interference ability

2.5 样品的检测

该方法在Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液中具有良好的检测性能,而实际样品成分比较复杂,影响因素较多,因此很多检测方法在复杂环境中的表现不够稳定,难以令人满意.为了评价该方法在复杂环境的表现能力,进一步检测湘江水中含有的Ag+浓度.如图7所示,荧光值随着河水中Ag+浓度的增加而增加,并在20～200nmol/L范围内呈线性关系(R2=0.998).尽管湘江水中存在一定量的矿物质和有机物,但是该方法还是能很好地检测出Ag+浓度,且最低检测下限可达10nmol/L,低于世界卫生组织(WHO)对饮用水的标准(0.1mg/L).此外,为了探讨样品中其他物质对检测体系的影响,我们对样品中的Ag+进行回收,结果表明回收率达到99.1%～103%,其相对误差处于1.0%～3.2%之间,如表2所示.由标回收率及相对误差证实该检测方法在样品中也具有很好的表现.因此该方法具有较大的实际应用潜力.

图7 实际样品中Ag+的灵敏性分析Fig.7 The sensitivity analysis of the method for Ag+ in real samples

表2 实际分析样品中Ag+ 的回收率Table 2 Recoveries of the proposed Ag+ assay in real samples

图8 实际样品中Ag+的特异性分析Fig.8 The specificity analysis of the method for Ag+ in real samples

为验证该生物传感器在实际样品中的特异性表现,对含有浓度均为150nmol/L的靶标离子与其他金属离子的湘江水样品进行检测.如图8所示,其他非靶标金属离子的荧光值远低于靶标离子的荧光值,因此该传感器在实际样品检测中同样具有的很好特异性.

3 讨论

本研究设计了一种操作简单、特异性强和灵敏度高的DNA探针,构建了基于分子信标和EXO III的荧光信号放大的生物传感器用于Ag+的检测.

DNA探针中间部分为适配体序列,两端为分子信标互补配对的序列.因为EXO II只能水解双链DNA3’端的平端和凹断,不能酶切凸端,在探针3’端多出4个碱基处于单链状态,避免被EXO III酶切.当DNA探针与Ag+结合后形成发卡结构,两端序列通过拼接与分子信标互补形成双链,但如果拼接部分没有间隔碱基,空间位阻大,分子信标则不能与之结合形成双链,相反如果距离过大,也会影响双链的形成,降低检测效果.所以有必要探究探针的设计.

在分子信标与DNA探针与Ag+形成复合物双链后加入EXO III,EXO III在体系中水解分子信标从而释放游离的荧光分子,使得探针与靶标复合物进入下一个循环,再与分子信标结合,荧光信号被循环放大.因此酶切时间是影响该方法检测的关键因素[7].

检测方法的灵敏度和选择性是评价优劣的关键.有很多研究报道利用Ag+核酸适配体结合碳纳米材料,该方法选择性高,但是1个靶标离子只能释放1个荧光分子,荧光强度低,方法的灵敏度不够高,且操作繁琐.也有很多研究报道基于Ag+核酸适配体的电化学传感器,该方法的灵敏度较高,但是传感器构建复杂,操作繁琐,还需特定昂贵的仪器设备.本研究利用核酸适配体结合分子信标和EXO III,使Ag+和适配体复合物反复与分子信标结合,然后水解产生FAM,一个靶标可产生多个荧光分子,因此荧光强度不断被放大,灵敏度显著提高,而且该方法操作简便,成本低廉,也无需昂贵的仪器设备,极容易在基层实验室完成Ag+检测,因此具有很强的实用性.

很多方法在缓冲液中的检测效果好,但是在实际样品中的检测却差强人意.电化学传感器很容易受复杂环境中带电物质的影响,从而影响传感器的表现[24].本实验通过优化各类实验条件并通过水样品的抗干扰实验证明该方法在实际样品具有很高的灵敏性和很强的特异性,因此在污水、食品与中药等样品的检测中具有很强的实用价值.

4 结论

4.1 DNA探针适配体区域与分子信标互补区域间隔碱基数为2个碱基时检测的信噪比最大,说明这种探针与分子信标的结合能力最好.

4.2 在DNA探针与Ag+形成发卡结构,其两端与分子信标形成双链后加EXO III,酶切的最佳时间为50min,检测的荧光值最大,检测效率最高.

4.3 将靶标离子加入到探针DNA和分子信标混合液中室温孵育50min,再加入2U的EXO III,室温育50min,设置激发波长495nm,发射波长530nm测定体系的荧光光谱.其检测下限(LOD)低至0.1nmol/L,且在Ag+浓度为0.5～200nmol/L范围内,荧光值与靶标浓度成线性关系(R2=0.994).

4.4 该方法的特异性高,在检测体系中加入非靶标离子,其荧光值很低基本等同于背景信号.当将大量非靶标离子和200nmol/L Ag+加入体系测得的荧光值是非靶标离子检测的荧光值的6倍,说明该方法抗干扰能力强.

4.5 该方法在检测湘江水实际样品中的Ag+时,在0～200nmol/L范围内呈线性关系(R2=0.998),其检测下限可达到10nmol/L,低于世界卫生组织(WHO)对饮用水的标准(0.1mg/L),且特异性强.因此该方法具有很强的实际应用价值.

4.6 该方法操作简单,成本低,不需要特殊昂贵的仪器设备,整个检测过程不到2h,检测速度快.

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