三硫烷二丁烯酸对金黄色葡萄球菌抑菌的研究

黄益娜，吴涛，刘锐，张民

（天津科技大学新农村发展研究院，食品生物技术教育部工程研究中心，天津科技大学食品生物技术与食品工程学院，天津 300457）

大蒜属多草本植物，蕴含着大量的多功能硫化合物，具有广谱抑菌、抗肿瘤、保护心血管系统、调节血糖和提高免疫等多种生物活性[1～6]，目前，对其研究大部分集中在大蒜素上，但是，由于大蒜素的不稳定及其提取分离纯化难度大，价格昂贵，导致其市场应用价值低，大蒜类生物医药制品等高端产品国内未见报道[7]。因此，工作者对其含硫化合物中S-S(S=O)键为母体进行了修饰合成、寻找合适的化合物成为当今研究的热点。Hisae等通过比较大蒜素(Allicin)、S-甲基亚磺酸硫代丙烯酯(AllS(O)Sme)、Z,E-亚硫酰基异丙烯酯(AllS(O)SPn-(Z,E))得出AllS(O)SMe、AllS(O)SPn-(Z,E)均有明显的抑菌作用，最小抑菌浓度（MIC值）分别为5 mg/mL、80 mg/mL、20 mg/mL，但是抑菌效果较大蒜素Allicin弱[8]。任方奎发现大蒜素的不同衍生物抑菌活性随着结构的变化而改变，其中二(3-甲基-2-丁烯基)三硫醚比大蒜素效果好[9]。Jay等[10]通过比较不同含硫化物抑菌强弱表明：二烯丙基四硫化物>二乙基四硫化物>二甲基四硫化物>二烯丙基二硫化物>二乙基三硫化物>二甲基三硫化物>二丙基二硫化物>烯丙基二硫化物。这些研究表明了大蒜硫化合物中S-S(S=O)键是主要的抑菌结构，其抑菌活性大小受其基团结构的影响。

近年来计算机技术的迅速发展，通过统计学方法以及揭示活性和结构之间的关系变化，以数学模型或图形概况来表征量变规律，从而避免大量人力物力和财力的浪费，使其在化学、药物设计、农药领域、医药领域和食品中的应用越来越广泛。但是，利用计算机技术通过构效关系构建模型来设计大蒜衍生物未见报道。本论文是通过前期构建比较分子力场Comparative Molecular Field Analysis (CoMFA)模型，以二烯丙基三硫化物（DATS）为母体来改造、设计一种新的化合物TSDB，其对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（MIC值）为16 μg/mL，抑菌强度是DATS的3倍，很好的提高了抑菌活性，并测定了生长曲线、电导率、培养液中蛋白含量基础上，采用蛋白质十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法、高效液相色谱测定有机酸变化、AnnexinV单染色法观察细胞凋亡情况，重点研究了TSDB的抑菌机理，从而将TSDB开发成为抑菌剂提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 菌株与试剂

金黄色葡萄球菌，天津科技大学菌株保藏中心提供；95%三硫烷二丁烯酸（TSDB）、95%二烯丙基三硫化物（DATS），大连茵泰科技有限公司提供；NB营养肉汤，国药集团化学试剂有限公司；蛋白Marker，Takara Bio；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）蛋白上样缓冲液等蛋白电泳相关试剂，北京索来宝科技有限公司；色谱纯L-苹果酸、L-乳酸、柠檬酸、草酸；磷酸二氢钾；甲醇；冰乙酸；考马斯亮蓝；Tris；甘氨酸等其他的试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

高效液相，日本岛津公司；倒置荧光显微，CKX41-FL；垂直蛋白质电泳仪，北京六一仪器厂；凝胶成像系统，北京六一仪器，高速小型台式离心机，Thermo Fisher；无菌操作台，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；灭菌锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；生化培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.3 方法

1.3.1 菌悬液的制备

无菌操作条件下，将保藏中的菌种接种到肉汤（牛肉膏蛋白胨）培养基中，37 ℃培养箱中培养24 h，重复两次。用接种环取活化后的菌液在斜面固体培养基上划线接种，37 ℃培养24 h。活化后的受试菌液于NB液体培养基中37 ℃下培养8 h，调整细菌的终浓度约为105CFU/mL。4 ℃保存备用。

1.3.2 SDS-PAGE电泳

参照文献[11]，将细菌接种于6 mL NB营养肉汤中培养至对数生长期后的菌液，实验组中加入MIC浓度的TSDB和DATS，未处理组为对照组，于37 ℃培养10 h，以4300 r/min离心10 min，去上清液，加入少量无菌PBS（pH=7.4)洗三次，加入300 μL的10 mg/mL溶菌酶溶液，37 ℃下放置20 min，4 ℃、4300 r/min离心5 min，取上清液30 μL加入10 μL Buffer，振荡，于100 ℃热水浴中10 min，15 μL上样进行SDS-PAGE电泳，染色、脱色、拍照观察菌体蛋白表达情况。

1.3.3 有机酸测定

按照文献[12]，取培养至对数生长期后的菌液，实验组中加入MIC浓度的TSDB和DATS，未处理组为对照组，于37 ℃培养10 h，43000 r/min离心5 min，弃上清，沉淀用无菌生理盐水洗涤两次后沸水浴10 min，取出后剧烈震荡，并将其于10000 r/min离心5 min，取上清液过0.22 μm微孔膜过滤后测定上清液中有机酸生成情况。

进样体积：10 μL；检测波长：210 nm；柱温：35 ℃；流动相：0.1 mol/L KH2PO4溶液（超纯水配制，pH 2.65）和乙腈，溶液比例采用程序梯度洗脱，流速0.5 mL/min。

1.3.4 AnnexinV细胞凋亡测试

将培养至对数生长期的菌液，调节菌体浓度大约为5×105CFU/mL，43000 r/min离心5 min，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞两次，加入500 μL结合液，加入5 μL Annexin V-FITC，轻轻混匀，室温避光孵育10 min，随后滴一滴上述细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞，于荧光显微镜下检测。

1.4 统计分析结果

所有试验重复三次，结果以X±SD（平均值±标准偏差）表示。采用SPSS 19.0对试验数据进行方差分析，差异显著采用Duncan法进行比较，p<0.05即认为存在显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 TSDB和DATS对蛋白质合成的影响

TSDB和DATS对金黄色葡萄球菌胞内蛋白合成的影响如图1所示。可以看出：对照组和处理组菌株活性蛋白电泳条带有较大的差异。主要表现为分子质量在44.3～200 ku之间的条带变模糊或者消失，比较TSDB处理与DATS蛋白图谱可知TSDB条带明显较DATS消失。

蛋白质图谱可以反映出它的全部基因组，因此功能蛋白质的变化可以由凝胶电泳图谱表现出来，其条带深浅的改变、增加或缺失都表明蛋白表达量有所变化[13]。SDS-PAGE电泳蛋白条带明显改变的现象，说明了受试化合物TSDB和DATS可能影响了菌体蛋白的正常表达或影响了其功能，改变了细菌某些关键的结构或功能蛋白的合成。TSDB条带明显较DATS消失，可能是因为新化合物TSDB比DATS多了功能团-COOH，使其与蛋白受体结合更牢固或者接触面积增大，从而加强了抑菌活性。Ankri等研究结果表明大蒜素主要抑菌机理是通过与巯基的化学作用（比如乙醇脱氢酶、硫氧还蛋白等还原酶和RNA聚合酶），从而影响半胱氨酸蛋白活性，抑制蛋白质合成来杀死细菌[14]。Saeed等人研究报道：蛋白质条带模糊和消失会随处理时间不同而不同，是由大蒜或其它植物提取物抑制了蛋白的合成、表达[15]。张纬等研究发现在柠檬提取物作用下，蛋白质条带在分子量为14.4～43.0 ku之间缺失或变浅，表明柠檬提取物改变细菌蛋白组成和表达量[16]。

图1 TSDB和DATS处理下金黄色葡萄球菌胞内蛋白SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of proteins extracted from S. aureus treated with TSDB and DATS

2.2 TSDB和DATS对有机酸代谢影响

图2 TSDB和DATS对Saureus胞内有机酸代谢影响Fig.2 Organic acids in the cell-supernatants after treating with the TSDB and DATS

代谢是一切生命形式活动的基本特征，微生物在代谢过程中，会产生多种的代谢产物，如氨基酸、核苷酸、有机酸等[17]。其代谢产物会受外界环境的变化而不同。

由图2中可知，实验组中苹果酸、草酸、柠檬酸和乳酸的含量相对于对照组明显下降，其TSDB处理组金黄色葡萄球菌胞内草酸和乳酸未检测到，而DATS组金黄色葡萄球菌胞内草酸含量下降至1.63 mg/L（降低了48.74%），是对照组的0.55倍；苹果酸含量分别下降至5.49 mg/L和6.62 mg/L(减少了65.16%和57.99%)，呈显著差异（p<0.05）。此外，TSDB组和DATS组柠檬酸含量分别减少至9.79 mg/L和12.32 mg/L（下降了56.18%、44.85%），表明TSDB处理组能够改变金黄色葡萄球菌中有机酸代谢，其中对草酸和苹果酸含量的影响强于DATS组。

金黄色葡萄球菌胞内有机酸含量明显的减少，说明TSDB和DATS改变金黄色葡萄球菌的细胞代谢途径。柠檬酸、苹果酸是三羧酸循环中的代谢产物，其含量明显的减少，说明TSDB和DATS有可能抑制三羧酸循环中柠檬酸合成酶等关键酶的活性，导致代谢无法正常进行[18,19]。同时，三羧酸循环中产生的苹果酸可以脱酸生成丙酮酸，并进一步参与其它代谢途径，由于TSDB和DATS处理使苹果酸含量显著降低，有可能导致中间代谢产物丙酮酸减少，进而对蛋白质、糖代谢造成一定影响。

2.3 TSDB和DATS对细胞凋亡的影响

AnnexinV是一种磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的磷脂酰丝氨酸（PS）高亲和力特异结合而呈现。PS外翻发生在细胞核破裂，DNA片段化出现之前，这使得AnnexinV与PS的结合成为凋亡早期的一种重要检测手段。TSDB和DATS处理后金黄色葡萄球菌细胞凋亡情况如图3所示。可以看出，未经处理组图中细胞膜表面呈苹果绿色的圆点很少，而TSDB和DATS处理后细胞出现苹果绿的圆点急剧增加，且TSDB组苹果绿圆点比DATS组多，说明化合物TSDB和DATS处理使得细胞膜内磷脂酰丝氨酸外翻，细胞凋亡。

实验结果间接说明，TSDB和DATS主要是破坏金黄色葡萄球菌的细胞膜，其中TSDB对细胞膜的破坏效果要强于DATS，前期实验室研究也表明大蒜降解产物主要是破坏大肠杆菌细胞膜，影响其内环境的改变，进而引起细胞凋亡[20]。研究报告大蒜素及其类似物对微生物的抑制机理一般为降解细胞壁，破坏细胞膜，内容物外漏，抑制蛋白质合成，导致细胞凋亡或坏死[21]。因此，细胞膜通透性增大，进而改变胞内外细胞正常代谢，最终导致细胞凋亡。

图3 TSDB和DATS处理后细胞凋亡情况Fig.3 Apoptosis of cells treated with TSDB and DATS

3 结论

TSDB对金黄色葡萄球菌SDS-PAGE电泳结果表明，TSDB影响细菌蛋白质代谢，可能促进代谢过程中蛋白质的降解；有机酸代谢实验发现，TSDB对金黄色葡萄球菌作用10 h后，胞内柠檬酸、草酸和苹果酸含量明显减少，表明此时的有机酸正常代谢受到影响；综上可知，TSDB主要是破坏细胞膜，扰乱了细胞的正常代谢，破坏蛋白质合成、有机酸代谢，从而导致细胞凋亡。因此，这一研究的发现为TSDB成为一种新型食品防腐剂提供理论支持。

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