免疫亲和高效液相色谱法测定小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的方法改进

何攀，闫冬阁，陈渠玲，李枣枣

（1.中南粮油食品科学研究院有限公司，湖南长沙 410000）（2.湖南粮食集团有限责任公司，湖南长沙 410000）

小麦是全球种植面积最大、总产量最高、也是最为重要的粮食作物，超过1/3的世界人口以小麦制品为主食。在中国，小麦仅次于第一大粮食作物水稻，总产量1.2亿吨左右，是中国半数以上人口的主粮[1]。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol），简写“DON”，又称呕吐毒素，属于单端孢霉烯族化合物，主要是由禾谷镰刀菌、黄色镰刀菌和雪腐镰刀菌等真菌产生的次级有毒代谢物[2,3]，是小麦等谷物中最为普遍发生的镰刀菌毒素[4]，DON的污染程度与降水、花期湿度和储藏条件密切相关[5]，世界各地均有关于该毒素的污染报道[6～9]，是世界上分布最广、污染最严重的霉菌毒素之一[10～14]。DON可以干扰核糖体肽基转移酶的活性，阻碍核糖体循环，抑制蛋白质的合成，导致头疼、头晕、呕吐、中枢神经系统紊乱、免疫功能障碍和繁殖功能障碍等症状[15～17]。

DON的污染对于小麦粉的储藏和食用安全的危害非常大，因此建立准确有效的DON检测方法尤为重要。液相色谱是目前检测小麦及其制品中DON最普遍使用的方法，今年更新的GB 5009.111-2016《食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》中的免疫亲和高效液相色谱法的色谱条件对于检测小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测存在出现假阳性的风险，而第一法同位素液相色谱串联质谱法，虽然干扰小但是检测成本高，仪器价格昂贵。关于液相色谱检测DON的方法研究文献还有很多，如罗颖鹏等[18]建立了固相萃取-高效液相色谱对小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇进行测定方法，研究优化了提取剂、净化方法、流动相组成及流速等条件，其优化后的色谱条件为流动相乙腈-水（6:95，V/V），流速0.9 mL/min，检测波长218 nm，DON检测结果良好，回收率达到90.12%～106.25%；陆源等[19]建立了免疫亲和柱净化-高效液相色谱法检测小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的分析方法，主要研究的是通过优化前处理方法，消除标准品中乙酸乙酯引起的溶剂效应，其测试的色谱条件为流动相甲醇-水（20:80，V/V），流速0.9 mL/min，检测波长218 nm；吴振兴等[20]建立小麦和玉米中脱氧雪腐镰刀菌烯醇与雪腐镰刀菌烯醇的免疫亲和净化-高效液相色谱检测方法，对色谱条件、提取液和净化柱的选择进行了优化研究，其优化后的色谱条件为流动相：10%乙腈水，流速：0.9 mL/min，检测波长218 nm；张羽等[21]主要研究了免疫亲和层析净化高效液相色谱法与酶联免疫吸附法的方法比较，其液相色谱条件为流动相甲醇-水（20:80，V/V），流速0.7 mL/min，检测波长218 nm，结果表明两种方法无显著性差异；金海涛等[22]建立了快速检测小麦中DON、ZON、T-2的高效液相色谱质谱方法，该方法能够一次快速检测小麦粉中3种毒素，具有速度快、准确度高的特点，其中三重四级杆的的多反应监测方式采集离子对，本身就具有辅助定性的功能，达到了定量检测DON的同时定性的目的。这些研究成果中的液相色谱法，均是设置紫外检测波长为218 nm来检测样品，未有通过改变检测波长来优化色谱条件的研究，除液相色谱-质谱联用能利用离子对进行辅助定性分析外，其他方法均未有对DON检测结果进行定性分析的研究报道。

本文研究的创新点在于在优化色谱分离条件的同时，通过改变紫外检测波长来降低杂质信号干扰，并利用二极管阵列检测器进行波长扫描，收集色谱结果为阳性的紫外吸收光谱，通过与建立的DON标准光谱普库进行匹配性检索的定性结果判断，能有效避免假阳性的出现，提高了样品检测的准确度，避免了假阳性检测结果的风险。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

小麦粉：市场购买；DON免疫亲和柱（柱容量1 mg，柱体积5 mL）：北京中检维康生物技术有限公司；甲醇（色谱纯）：国药集团；超纯水（18.25 MΩ）：中沃水务纯水机；脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准溶液（200 μg/mL，1 mL，批号CDGG-014445-06）：o2si公司；其他必要分析纯试剂均购自国药集团。

1.1.2 主要仪器设备

安捷伦1260型高效液相色谱仪：配二极管阵列检测器；FA1104N型电子天平：上海菁海仪器有限公司；MD200-1型氮吹仪：杭州奥盛仪器有限公司；TGL16G型高速离心机：上海菲恰尔分析仪器有限公司；HY-2调速多用振荡器：金坛市恒丰仪器制造有限公司；ZWM-LSI-20型超纯水机：中沃水务；W-SPE 24型固相萃取仪：北京莱伯泰科仪器股份有限公司；玻璃纤维滤纸：直径11 cm，孔径1.5 μm；水相微孔滤膜：0.45 μm；聚丙烯刻度离心管：具塞，50 mL；玻璃注射器：10 mL。

1.2 方法

1.2.1 DON标准溶液的配制

准确移取适量DON标准储备溶液用初始流动相稀释，配制成50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL、1000 ng/mL、2000 ng/mL和5000 ng/mL的标准系列工作液。

1.2.2 样品预处理

样品提取：称取5.00 g小麦粉于50 mL离心管中加1 g聚乙二醇，加水20 mL，混匀，置于多功能振荡器中振荡20 min。5000 r/min下离心5 min，用玻璃滤纸过滤，收集滤液进行净化处理。

样品的净化、洗脱和浓缩：将2.00 mL样品滤液以每秒1滴的速度通过已恢复常温的DON免疫亲和柱，并分别用5 mL PBS缓冲盐溶液（pH=7.4）和5 mL水先后淋洗免疫亲和柱，控制流速为每秒1滴～2滴，直至空气进入亲和柱中，弃去全部流出液，抽干小柱，准确加入2.0 mL甲醇洗脱亲和柱，控制每秒1滴的速度，收集全部洗脱液至试管中，在50 ℃下用氮气缓缓地将洗脱液吹至近干，加入1.0 mL初始流动相，涡旋30 s溶解残留物，0.45 μm滤膜过滤，收集滤液于进样瓶中以备进样。

1.2.3 色谱条件

色谱柱：安捷伦ZORBAX Eclipse PAH-C18（柱长150 mm，柱内径4.6 mm，粒径5 μm）；流动相：甲醇+水（25+75）；流速：0.8 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：50 μL；二极管阵列检测器：波长240 nm，狭缝宽4 nm，波长扫描范围190 nm～400 nm。

2 结果与讨论

2.1 流动相甲醇与水比率优化

图1 不同流动相组成的DON样品色谱图Fig.1 Chromatograms of DON with different mobile phases

流动相甲醇与水的比率对DON与样品杂质的的分离度的影响很大，在波长设为国家标准规定的218 nm的时候，本文研究了不同比率的甲醇与水对样品分离度的影响，结果如下图1所示，随着流动相中甲醇比率增加，DON出峰越早，DON与杂质的分离度也随之变化，当甲醇-水（25:75，V/V）的时候，DON的分离度最好。如果按照国标规定的甲醇-水（15:75，V/V），目标峰DON与大杂质峰几乎完全重合，极易将样品判定为假阳性的结果。大杂质峰可能是与DON分子结构相近的的能被免疫亲和柱保留并洗脱的物质。

2.2 检测波长的优化

虽然对流动相甲醇与水的比率进行了优化，将DON与杂质峰分离出来了，但是大的杂质峰依然对DON目标峰存在一定干扰，由图1可知，杂质峰紧挨着DON目标峰出峰，并且信号比目标峰强很多，为了排除杂质峰可能对DON目标峰检测存在的干扰，本文通过研究干扰杂质峰与目标峰的紫外吸收波长，重新设计了检测波长，结果如下图2所示，从图中结果可以看出，当波长为218 nm的时候，DON有最大吸收峰，但同时杂质的吸收信号也很强，但是当波长为240 nm的时候，杂质峰的吸收信号下降83%，而DON的吸收峰，信号只下降了38%，本文通过研究发现，通过波长设置，可以显著降低杂质峰的信号，并且还能保证DON目标物的检出限，其检出限能达到20 μg/kg，低于国标规定的100 μg/kg，这部分将在2.4的方法验证中再讨论，通过波长设置，在显著降低干扰信号的同时，很好地保留DON目标物的检出限，所以本文在检测小麦粉中DON的时候检测波长应该设置为240 nm。波长设置为218 nm与240 nm的对比图如下图3所示，由图3可知，杂质峰信号下降明显，对DON峰检测的干扰也会小很多。

图2 DON紫外吸收图谱与干扰峰紫外吸收图谱峰的比较Fig.2 Comparison of ultraviolet absorption spectra of DON and interference peaks

图3 波长设置为218 nm与240 nm的样品色谱的比较Fig.3 Comparison of sample chromatography with the wavelength of 218 nm, 240 nm

2.3 二极管阵列检测器定性确证排除假阳性

在国标GB 5009.111-2016《食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》中第一法为同位素稀释液相色谱-串联质谱法（2017年6月23号实施），此法虽然能有效避免假阳性的出现，提高样品检测准确度，但是仪器设备昂贵，检测成本高昂，对检验员技术能力要求很高，不是一般实验室所能配备和使用。

本文通过二极管阵列检测器可对色谱峰每个时刻进行紫外全波长扫描的功能，研究了DON的定性检测方法。建立了DON的标准紫外吸收光谱普库，标样色谱图与样品色谱测试结果见图4。

图4 标准物质色谱图与样品色谱图的比较Fig.4 Chromatograms of standard and sample

图5 DON的标准紫外吸收图谱Fig.5 UV absorption spectrum of DON Standard

图6 光谱检索结果图Fig.6 Spectral retrieval results

从标样色谱图中提取DON在190 nm～400 nm的光谱图结果见图5，通过建立的DON标准紫外吸收普库与从样品色谱图中提取的的DON目标峰及干扰杂质峰的光谱图进行检索得到的结果如图6。

从图6的结果可以明显看出，干扰杂质峰的光谱与普库光谱比较光谱偏差很大，匹配度通过色谱软件计算只有34.4%非常低，而DON目标峰的光谱与普库光谱比较光谱偏差非常小，匹配度通过色谱处理软件计算能达到99.7%。

通过设置光谱匹配度达到95%以上可确证为DON的方法进行辅助的定性分析能有效避免假阳性的出现，提高了样品检测的准确度，与液相色谱串联质谱相比能节省大量检测成本。

2.4 方法验证

2.4.1 标准曲线及线性范围

以25%的甲醇溶液配制DON的梯度系列标准溶液，以所得峰面积（Y）为纵坐标，进样标准溶液浓度（ng/mL）为横坐标（X），绘制回归方程为：Y=0.04084X-0.0506，相关系数：0.99989，线性范围50 ng/mL～5000 ng/mL，结果如图7所示线性关系良好。

2.4.2 回收率与精密度

取未被DON污染的小麦粉样品进行三水平加标试验，加标后样品中DON浓度分别为50 μg/kg、2000 μg/kg和500 μg/kg，按照样品前处理方法进行上机测试，每个加标样平行测试6次，计算回收率和精密度，其结果见表1。其样品加标的回收率在91.7%～97.2%，精密度（relative standard deviation，RSD）0.83%～3.21%，具有较高的回收率和较低的RSD值。

2.4.3 检出限与定量限

图7 回归曲线Fig.7 Regression curve

取未被DON污染的小麦粉样品加标成3倍信噪比信号的浓度样品和10倍信噪比浓度的样品进行测试，测得检出限为20 μg/kg，定量限为66.7 μg/kg。

表1 回收率与精密度Table 1 Recovery and precision

3 结论

本文研究了2017年6月23号实施的GB 5009.111-2016《食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》中第二法的免疫亲高效液相色谱法，优化了其色谱条件，结果表明：当流动相为甲醇-水（25:75，V/V），DON与样品测试液中杂质有最好的分离度，检测波长设置为240 nm时，在保证DON检测灵敏度的同时显著降低了干扰杂质峰的信号，降低了假阳性误判的风险，对优化的色谱条件进行了方法验证试验，达到了良好的线性范围、较低的检出限、较高的回收率和检测精密度，并且本文还研究了二极管阵列检测器检测DON的定性分析方法，即通过设置检测波长扫描范围为190 nm～400 nm，提取标准样品色谱图中的目标峰光谱图，建立了DON的紫外吸收图谱普库，通过提取样品色谱图中目标峰的光谱图，对检出的目标色谱峰进行标准普库检索，弥补了之前对于液相色谱检测DON的定性分析的不足，达到了定性确证的目的，更加有效避免了假阳性的误判。

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