细菌对氟苯尼考的耐药机制研究进展

2018-03-01刘蔚雯

中国动物传染病学报 2018年1期

关键词：氟苯尼外排球菌

刘蔚雯，汪洋

（中国农业大学动物医学院，北京 100193）

细菌对氟苯尼考的耐药机制研究进展

刘蔚雯，汪洋

（中国农业大学动物医学院，北京 100193）

汪洋，教授，博士生导师，国家自然科学基金优秀青年基金获得者。现就职于中国农业大学动物医学院，食品营养与人类健康高精尖创新中心暨食品质量与安全北京实验室。2006年以来一直从事细菌耐药性的产生、传播和控制方面的基础研究。主持国家自然科学基金项目3项、国家科技部“973”项目子课题1项；参加国家自然科学基金国际合作交流中英项目和中瑞项目各1项。在国外学术刊物Lancet Infectious Disease，Nature Microbiology，Emerging Infectious Disease, mBio等发表SCI收录论文90余篇，其中第一作者和通讯作者SCI论文45篇。参加编写英文专著2部；获得国家专利2项。2013年获得“大北农青年学者奖”。

氟苯尼考是一种动物专用的新型酰胺醇类广谱抗菌药物，因其良好的药效学特征，在兽医临床上被广泛应用于预防或治疗细菌性感染。伴随着养殖业的大量使用，细菌对氟苯尼考耐药性日益严重，特别是部分细菌对酰胺醇类和人医临床治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）、耐万古霉素肠球菌（vancomycin-resistant Enterococcus，VRE）等多重耐药病原菌的特效抗菌药物恶唑烷酮类存在交叉耐药现象，对人类健康和公共卫生安全造成巨大威胁。因此，本文对目前已报道的氟苯尼考耐药机制做一综述，为有效控制氟苯尼考耐药菌株的发生与流行提供理论指导，同时也为兽医临床合理用药及氟苯尼考耐药菌对人与动物健康的风险评估提供数据参考。

氟苯尼考；耐药性；耐药机制

氟苯尼考，又名氟甲砜霉素，是氯霉素的氟化衍生物，为动物专用的酰胺醇类广谱抗生素。1988年由美国先灵葆雅（Schefing-Plough）公司研制成功。1990年在日本上市，随后在挪威、法国、加拿大、墨西哥、巴西、智利、美国等多个国家中批准应用，我国亦于1999年通过了该药的审批[1]。氟苯尼考具有抗菌谱广，吸收迅速，体内分布广泛，残留低，不产生再生障碍性贫血等不良反应以及对氯霉素耐药菌株敏感的优点，主要用于防治由沙门氏菌、大肠杆菌、巴氏杆菌等引起的禽下痢、霍乱、顽固性腹泻；以及防治猪的传染性胸膜肺炎、气喘病、萎缩性鼻炎、猪肺疫、链球菌病等[2]。据统计数据显示，我国在2013年兽用抗菌药物的总用量为8.4万吨，其中氟苯尼考即高达1万吨，排在所有兽用抗菌药物用量的前列[3]。目前，氟苯尼考已成为国内畜禽养殖及水产中应用最为广泛的抗菌药物之一。

氟苯尼考主要作用于细菌70S核糖体的50S亚基，与其A位（受位）结合，抑制了肽酰转移酶的转肽反应，抑制肽链的延伸，从而阻止蛋白质的合成，达到抑制细菌生长的目的[2]。随着养殖业的迅速发展，氟苯尼考在兽医临床上广泛使用，甚至不合理的使用，耐氟苯尼考菌株出现并逐渐增多，导致临床抗菌药物治疗效果显著下降，疾病迁延不愈等严重后果。本文重点阐述细菌对氟苯尼考的耐药机制。

1 外排泵介导的主动外排作用

外排泵由染色体或质粒上的相关基因编码，是一种在能量参与下（ATP分解或质子运动力）将底物泵出菌体的转运蛋白，本质是具有转运功能的膜蛋白。细菌可通过外排泵系统将进入菌体内的抗菌药物泵出，从而使菌体内的药物浓度降低，导致耐药性的产生。外排泵在酰胺醇类药物耐药中发挥着重要作用，包括特异性外排泵和非特异性外排泵。

1.1 特异性外排泵

1.1.1floR1996年，首先从日本海鱼分离的一株杀鱼巴德杆菌中发现了可介导氟苯尼考耐药的可转移R质粒，该质粒含有一个1122 bp的完整ORF，编码374个氨基酸，位于磺胺类药物耐药基因sul的下游，命名为pp-flo（pasteurella piscicida-florfenicol resistance gene）[4]。随后研究发现在沙门氏菌、鲍曼不动杆菌、多杀性巴氏杆菌、支气管败血性博氏杆菌、嗜水气单胞菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠杆菌和嗜麦芽窄食单胞菌等许多革兰氏阴性菌中都存在该基因。尽管这些floR基因变体在不同文献中被命名为ppflo、cmlA-like、floSt、floR和floRv，但它们之间的核酸序列同源性均超过80%[5-11]。floR基因主要存在于质粒上，少数定位于基因岛。目前该类型的外排泵仅在革兰氏阴性菌中检测到。

1.1.2fexA2004年，Kehrenbery等[12]在缓慢葡萄球菌pSCF2质粒中首次发现fexA（for florfenicol exporter A）基因。FexA蛋白由475个氨基酸组成，含14个跨膜域，可同时介导对氯霉素和氟苯尼考耐药。随后检测fexA基因侧翼序列，发现其存在于新型转座子Tn558中[13]。fexA基因极易通过转座子传播扩散。之后，在金黄色葡萄球菌中（包括MRSA）亦检测到了fexA基因[14-17]。2010年，在革兰氏阳性菌芽孢杆菌中也发现了该基因，且定位于转座子Tn558变体中，推测Tn558对fexA基因在不同细菌菌属间传播起重要作用[18]。

1.1.3fexB2012年，刘河冰等[19]从猪源屎肠球菌和海氏肠球菌中首次发现fexB基因。它是继fexA基因后，在革兰氏阳性菌发现的第二个氟苯尼考外排泵基因。该基因定位于质粒上，所编码的FexB蛋白由469个氨基酸组成，与FexA氨基酸序列的同源性仅为56.1%，但同样含14个跨膜域，且功能性试验表现出对氯霉素和氟苯尼考的抗性。对携带fexB基因的质粒遗传环境的分析显示其含有至少两个插入序列IS1216，而这个转座酶在肠球菌中很常见，推测IS1216在fexB基因的水平传播中发挥重要作用。目前为止，该基因仅从肠球菌中发现，未见其他种属细菌报道。

1.1.4pexA2010年，从阿拉斯加土壤的宏基因组样本中检出了pexA基因（phenicol exporter A），其编码的蛋白结构与主要易化子超家族（major facilitator superfamily，MFS）相似，介导氯霉素和氟苯尼考耐药[20]。到目前尚未发现有耐药菌株携带该基因，该基因的宿主可能来自土壤中难以常规培养的细菌。

1.2 非特异性外排泵相对特异性外排泵，非特异性（多药）外排泵介导细菌对氟苯尼考表现出较低水平的耐药。2004年，Baucheron等[21]从多耐药鼠伤寒沙门氏菌DT104 中发现ATP结合盒超家族（ATP-binding cassette superfamily，ABC）AcrAB-Tolc多药外排泵可同时介导喹诺酮类、氯霉素、氟苯尼考和四环素类药物耐药。此外，姚红等[22]2016年在我国动物源空肠弯曲菌中发现了外排泵变异体RECmeABC，该变异体属耐药结节化细胞分化家族（resistance nodulation division，RND），使得弯曲菌对氟喹诺酮类、酰胺醇类、大环内酯类及四环素类药物的敏感性降低。

2 靶位改变

抗菌药物作用的靶位发生突变或被细菌产生的某种酶修饰，从而使抗菌药物无法结合或亲和力下降，导致耐药性的出现。靶位修饰是氟苯尼考耐药的另一重要机制。

2.1 cfr 2000年，Schwarz等[23]首先在小牛鼻拭子中分离的松鼠葡萄球菌pSCF1质粒中发现了能够介导松鼠葡萄球菌对氯霉素和氟苯尼考耐药的cfr（chloramphenicol-florfenicol resistance）基因。进一步研究表明cfr基因编码23S rRNA甲基转移酶，作用于核糖体肽转移中心（peptidyl transferase center，PTC）的A2503和C2498位点，使A2503发生腺嘌呤残基甲基化的同时，抑制C2498甲基化。由于结合位点与林可胺类、截短侧耳素类、恶唑烷酮类（利奈唑胺）和链阳霉素A类药物的结合位点部分重叠（图1），且A2503位点甲基化导致23S rRNA中上述五类药物的结合位点构型发生改变而导致对此五类药物耐药（PhLOPSA）[24,25]。值得注意的是，利奈唑胺是治疗耐万古霉素肠球菌（vancomycin-resistantEnterococcus，VRE）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MASA）、耐青霉素肺炎链球菌（penicillin-resistantStreptococcus pneumoniae，PRSP）的最后一道防线[26]。cfr基因定位于各种可移动性元件如质粒、转座子或插入序列中，易于在不同菌株和菌种之间传播扩散。目前已发现cfr基因广泛存在于世界各地人源和动物源多种革兰氏阳性菌以及革兰氏阴性菌中[27]。因此，可转移的多重耐药基因cfr的出现严重威胁着人类与动物健康。

2.2 cfr(B) 2015年在艰难梭菌中首次发现了与cfr编码氨基酸序列同源性为74.9%的cfr(B)。该基因同样介导酰胺醇类、林可胺类、截短侧耳素类、恶唑烷酮类和链阳霉素A类药物耐药[28]。在屎肠球菌亦有cfr(B)检出[29]。

3 酶的水解作用

细菌可产生降解抗菌药物的酶，使抗菌药物失效，导致细菌耐药性产生。Tao等[31]从土壤宏基因组中发现编码醋酸酯酶的eatDL136基因能够水解氯霉素和氟苯尼考的酰胺键而使其失去抗菌活性，但目前尚无病原微生物携带eatDL136基因的报道。

4 其他机制

4.1 optrA 2015年，汪洋等[32]在我国人源和动物源的粪肠球菌和屎肠球菌中发现新型耐药基因optrA（oxazolidinone-phenicol transferable resistance A），该基因定位于质粒上，编码ATP结合盒转运体，介导恶唑烷酮类药物和酰胺醇类药物耐药。optrA类转运蛋白缺乏跨膜结构，目前其具体耐药机制尚未完全明了。值得注意的是其不仅介导利奈唑胺耐药，且对同属于恶唑烷酮类的泰地唑利表现抗性。泰地唑利是美国食品药品监督管理局（FDA）2014年批准的新药，临床试验显示泰地唑利可有效治疗由携带cfr基因革兰氏阳性菌所引起的感染性疾病[33-35]。且回溯性研究表明在中国批准使用利奈唑胺前，已存在恶唑烷酮类耐药基因optrA，提示该基因的出现很可能为酰胺醇类药物的选择压力所致[36]。何涛等[37]对17株携带optrA基因粪肠球菌进行遗传环境比较分析，结果显示定位于不同来源质粒上的optrA基因上游区域和/或下游区域均存在插入序列IS1216E（图2），该结构可重组形成一个不稳定的环状中间体，从质粒上脱离，促进optrA的传播扩散。2016年报道了首例葡萄球菌（松鼠葡萄球菌）携带optrA基因，且与cfr基因共同于同一质粒[38]。后续研究表明，转座子Tn558对optrA在松鼠葡萄球菌中的传播具有重要的作用[39]。

自1990年上市以来，氟苯尼考为保障畜牧业的健康发展作出了重要贡献。与此同时，氟苯尼考的耐药情况越发严重，新的耐药机制不断被发现，耐药机制越发复杂。一方面，氟苯尼考耐药基因主要位于可移动元件上，易于传播扩散，加大动物疫病防治的难度；另一方面，动物源细菌产生的氟苯尼考耐药基因能同时介导人类治疗革兰氏阳性菌重要一线药物恶唑烷酮类、链阳霉素A类药物的耐药，严重威胁公共卫生和人类健康。因此，必须规范氟苯尼考在动物养殖业的合理使用，加强对其耐药性的发生与流行的监控，并对其在养殖业中的使用和所造成的多重耐药基因传播的风险进行重新评估。

图1 Cfr蛋白结合位点与林可胺类、截短侧耳素类和链阳霉素A类药物结合位点于PTC重叠[25]Fig.1 Binding of the phenicol, lincosamide, pleuromutilin, and streptogramin A classes of antimicrobials to overlapping sites at the ribosomal peptidyl transferase center [25]

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MECHANISMS OF BACTERIAL RESISTANCE TO FLORFENICOL

LIU Wei-wen, WANG Yang

(College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing 100193, China)

As a new broad spectrum amphenicol, florfenicol performs excellent anti-bacterial infections and is now widely used in animal clinical treatment. However, the extensive usage of fl orfenicol leads to the increasing trends of bacterial resistance. Particularly,a few fl orfenicol resistance genes also causes no ef fi cacy of oxazolidinones, which are effective in human clinical treatment for multiresistant bacterial infections including methicillin-resistant Staphylococcus aureus and vancomycin-resistant enterococci, therefore posing a signi fi cant threat to public health. This review summarizes the current knowledge of mechanisms of bacterial resistance to fl orfenicol in order to provide the theoretical guidance for control of the occurrence and dissemination of fl orfenicol-resistant strains and the reference data for rational administration of drugs in veterinary practice as well as the risk assessment for human and animal health.

Florfenicol; resistance; mechanisms

S859.796

1674-6422（2018）01-0001-06

2017-08-18

刘蔚雯，女，硕士研究生，基础兽医学专业

汪洋，E-mail：wangyang@cau.edu.cn

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