主动外排系统RND家族最新研究进展

王 惠， 冯 媛， 王崇刚

我国是面临细菌耐药性威胁最为严重的国家之一。在所有耐药病原体中，粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌属细菌（ESKAPE）占医院感染的大多数，且耐药率持续增长[1]。根据2017年CHINET中国细菌耐药监测数据表明革兰阴性菌检出率约占70%[2]，其耐药性日趋严重。抗药性起源多且复杂，而多药耐药通常与外排泵相关。革兰阴性菌以多种方式适应抗菌药物的选择压力，包括外排泵的（过）表达。目前，已经鉴定了6类外排泵家族[3]，包括仅存在于革兰阴性菌的抗性-结瘤-细胞分裂（RND）超家族[4]，外排泵RND家族参与细菌的生理、代谢及致病[5-6]，并在介导多药耐药中发挥重要作用。本文主要介绍临床常见革兰阴性菌大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌外排泵的结构、生理功能及在生物膜形成中的作用等最新进展，为外排泵抑制剂的研发提供新思 路。

1 外排泵结构

RND转运蛋白家族由蘑菇状同源三聚体的内膜转运蛋白（IMP）、漏斗状六聚体的周质融合蛋白（MFP）和同源三聚体的外膜外排蛋白（OEP）组成。MFP位于周质空间桥接IMP和OEP，IMP利用质子梯度通过质子/底物反转运机制驱动底物排入到OEP中。以下将分别阐述3种细菌的外排泵RND家族结构。

1.1 大肠埃希菌

RND超家族的AcrAB-TolC复合体是大肠埃希菌的主要外排泵[7]，该泵组件包括外膜通道蛋白TolC，位于内膜的转运蛋白AcrB和周质蛋白融合蛋白AcrA。外排泵各个亚基之间相互作用且在泵内组织，直到AcrAB-TolC复合物的第一个伪原子结构（pseudo-atomic structure）公布[8]，泵的整体形状以及其组成的相对排列，通过电子显微镜研究得以揭示[9-10]，详细描述了处于静止状态和药物传输状态完整的AcrAB-TolC组装以及相关的三级和四级结构变化[11]。正如Du等[8]提出，AcrB与TolC之间没有直接的相互作用，但AcrA与两者都分别作用。近期研究通过低温电子断层扫描术（cryo-ET）证实了AcrAB-TolC外排泵的结构，提出在存在抗生素的情况下，AcrAB复合体通过改变其构象募集TolC[12]。肽聚糖在AcrAB-TolC的组装过程中起重要作用，AcrA的α-发夹结构域与肽聚糖结合有助于维持AcrAB复合体在细胞包膜中的稳定性，同时当 AcrB与底物结合时有助于TolC与AcrAB复合体连接，证实了AcrAB-TolC泵的结构及其在天然细胞膜环境中的中间组装状态，提出可以通过干预AcrA与肽聚糖或AcrB之间的相互作用而阻断AcrAB-TolC的组装。

1.2 铜绿假单胞菌

迄今已知，铜绿假单胞菌中至少存在12种RND型，MexAB-OprM和MexXY-OprM是细菌在感染机体过程中存活和产生固有耐药性的主要外排系统[13]。MexAB-OprM是与大肠埃希菌AcrABTolC同源的系统，由内膜蛋白MexB、外膜蛋白OprM和周质膜融合蛋白MexA三部分组成。AcrB和MexB的氨基酸序列同源性为70%，AcrA和MexA的同源性为57%，TolC和OprM的同源性为19%[14]。过去认为MFP和IMP形成高度特异性结合，不允许同源泵之间相互交换。例如，MexA和MexB在功能上不能与该菌中的任何其他多药耐药外排泵系统互换[15]，然而已有研究报道MexB与AcrA和TolC的功能相互作用，Daury等[10]发现组装过程中将MexB与AcrB互换时，可组装AcrAMexB-TolC复合物，但与原复合物的形成相比发生率较低，提出可能存在通用的机制触发外排泵的组装，形成效率取决于MFP的结合亲和力，由此可通过阻止蛋白质/蛋白质识别或通过阻碍其结构适应性影响泵效率，为外排泵抑制剂提供新思路。Lopez等[16]对MexA-OprM组装研究发现，OprM需要与MexA组装成药物结合样构象才能打开OprM周质孔，同样也需要通过周质结构域和外部结构域之间的相互作用来介导MexB开放并使整个泵正常工作。最近Tsutsumi 等[17]研究也证实OprM与MexA具有协同作用，通过开放周质孔而被激活。该团队构建完整的MexAB-OprM泵模型，提出MexA-MexB复合物比MexA-OprM复合物更稳定，并且MexA可能在OprM之前与MexB形成复合物，目前尚需要进一步的动态结构研究[例如分子动力学（MD）模拟]予以验证。

1.3 鲍曼不动杆菌

耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌在我国分离率最高可达90%[2]。鲍曼不动杆菌RND家族主要外排泵是AdeABC、AdeFGH和AdeIJK。Su等[18]研究发现脂质分子在AdeB三聚体的内部表面形成一个环并结合在细胞质膜小叶上，其可能参与了AdeB三聚体的稳定作用，该研究还提出质子的流入和药物的流出在转运周期内是相互协调并同步进行 的。

2 外排泵的生理功能

2.1 外排泵介导的固有耐药

细菌固有耐药是指其通过固有的结构或功能特性降低特定抗生素功效的能力[19]，RND外排泵家族是革兰阴性菌多药耐药的重要原因，如AcrAB-TolC外排泵具有底物广泛的特异性，能够排出多种化合物，包括β内酰胺类、四环素类、氟喹诺酮类、利福平类抗菌药物等[20]。AdeABC外排泵系统介导了对多种抗菌药物的抗药性，过去研究认为临床分离株中的多药耐药表型是由于其过表达引起的，如Yoon等[21]在具有免疫功能的小鼠全身及肺部感染模型中，对鲍曼不动杆菌体内适应性和毒力进行了评估，仅在腹膜内接种后才观察到过表达AdeABC鲍曼不动杆菌在宿主中的适应性降低，而在鼻内接种后则没有观察到，表明鼻内感染对小鼠更具毒性并刺激增强肺中性粒细胞活化，该研究解释了呼吸机相关性肺炎常见于AdeABC外排泵过表达的原因。但近期研究证明外排泵在抗生素耐药性中的作用更为复杂并取决于特定的生理环境，外排泵对鲍曼不动杆菌的耐药性作用仅限于少数几种抗生素，并且流出泵过量生产对抗生素敏感性的影响是明显低于先前报道的临床分离株[22-23]，表明涉及额外的抗性机制，特别是改善细菌细胞的渗透屏障并与主动外排泵协同作用的机制[24]。

近年有文献报道外排泵表达在细胞间差异的重要性[20，25]。例如，在大肠埃希菌中，AcrAB-TolC泵异质分配，泵聚集在旧极点，表现出对母代细胞的偏倚，导致外排泵表达较高的细胞亚群中的抗性水平升高[25]。RND外排泵在慢性细菌感染中也发挥重要作用，Pu等[20]发现编码外排泵的基因包括tolC、acrA和acrB，在持留菌中表达更高，且主动外排要先于主动休眠，同时进一步证实了TolC表达与细菌持久性生存呈正相关，而这种瞬时抗药性机制在持留菌顽固性和反复感染中起关键作用。

2.2 外排泵介导的获得性耐药

细菌可以通过瞬时耐药机制使细菌暂时耐药，即细菌通过休眠进行“被动防御”、利用外排泵来泵出抗生素进行“主动防御”，也可以通过基因突变或水平基因转移获得耐药基因[26]，从而增加细菌在抗生素应用下的适应性。耐药性的获得极大地促进了多重耐药菌株的产生，增加了抗感染治疗的难度。

2.2.1 基因突变 研究发现细菌耐受性（tolerance）要先于耐药性，在持久性状态下，耐受细胞抗性基因突变概率增加[27]，其机制与外排泵相关：大肠埃希菌AcrAB-TolC水平升高导致DNA错配修复基因mutS表达降低，MutS降低会造成错配修复（MMR）和短补丁修复（VSP）系统功能缺陷或降低，同时MutS可抑制RecA介导的链转移，mutS表达降低的细胞在种间杂交中重组增加[28]。Ei Meouche等[29]发现大肠埃希菌AcrABTolC外排泵表达水平较高的细胞具有DNA错配修复基因mutS表达较低、生长速率降低以及突变频率增加。证实了AcrAB外排泵表达升高引起的瞬时抗药性可以促进单个细胞内的自发突变，表明细胞间外排泵表达异质性除了在瞬时抗药性中产生差异，还会导致自发突变率的差异。目前尚不清楚mutS是由AcrAB-TolC直接调控，还是AcrAB调控或两者共同调控。

2.2.2 基因水平转移 细菌耐药性的传播主要方式是耐药基因的水平转移，最常见的是从环境中其他细菌获得的染色体外元件，如质粒、转座子和整合子等。Nolivos等[30]利用荧光显微镜成像系统观察大肠埃希菌在单细胞水平质粒的转移，该质粒携带有编码TetA外排泵（主动外排四环素）的tet操纵子及调节tetA表达的TetR阻遏物。研究发现在四环素存在的情况下，（36.2±12.5）%敏感受体菌株仍可获得四环素耐药性，表明尽管四环素对蛋白质合成有抑制作用，但获得质粒后受体菌仍可合成TetA外排泵。进一步研究发现AcrAB-TolC外排泵能有效降低敏感菌中四环素的浓度，确保从新获得的质粒中合成TetA泵。该团队同时检测了其他底物如利福平（抑制转录）和氯霉素或红霉素（抑制翻译）等，证实了AcrABTolc外排泵减轻药物对F质粒转移后耐药基因表达的抑制作用，包括质粒ssDNA转化为dsDNA，抗性基因转录为mRNA以及蛋白质合成。

2.3 外排泵在生物膜形成的作用

生物膜的形成在鲍曼不动杆菌感染宿主中起着重要作用，还导致医疗设备相关感染。多项研究发现与浮游状态相比，形成生物膜状态细菌的外排基因表达增加[31]，后者比前者对抗生素的耐受性高。研究表明外排泵的缺失或抑制与生物膜形成明显减少有关[22]，生物膜是细菌耐药的重要组成部分，外排泵在其形成中起到重要作用，一项研究表明RND超家族的AcrB和MdtABC泵有助于维持生物膜[32]。缺失acrB和mdtABC基因的突变株在4 h时可正常形成生物膜，随着时间推移生物膜逐渐减少并在24 h内明显减少，实验表明AcrB和MdtABC不参与外排生物膜形成所需的底物，但它们外排维持生物膜所必需的信号因子。 最近，Bay等[33]发现与野生株相比，缺乏acrB、acrA和tolC基因的大肠埃希菌突变株对生物膜生长有明显抑制作用，并对抗菌药物的敏感性更高。 He等[34]报道，鲍曼不动杆菌临床分离株形成的生物膜与AdeFGH外排泵的过表达有关。

生物膜形成的调控主要取决于群体感应系统，大部分革兰阴性菌的群体感应系统是由双组分LuxI/R型信号系统调控，该系统产生两种主要AHL（N-酰基-L-高丝氨酸内酯）信号分子，即3OC12-HSL（3-氧代十二烷酰高丝氨酸内酯）和C4-HSL（N-丁酰高丝氨酸内酯）。外排泵在生物膜形成所需的群体感应信号分子运输中发挥作用，一项经典研究发现用叠氮化物（胞质膜质子梯度抑制剂）处理过的野生型铜绿假单孢菌细胞内蓄积大量3OC12-HSL，此外，缺乏MexABOprM外排泵的铜绿假单胞菌突变体也显示出3 OC12-HSL的细胞内强蓄积性并减少了生物膜形成，这项研究表明3OC12-HSL是MexAB-OprM的天然底物并参与其外排[35]。另一项研究也证实分别编码生物膜发育所需的AHL和AdeFGH外排泵的abaI和abeG基因上调，AdeFGH外排泵的过表达可能会加速AHL在生物膜形成期间的外排[36]。提示可使用外排泵抑制剂与抗菌药物联合，以减少致病菌在肺中的定植。

3 展望

外排泵RND家族对于革兰阴性菌的生存至关重要，其参与细菌群体感应、毒力及生物膜的形成、参与细菌耐药基因的水平转移及基因突变、参与细菌瞬时和持久耐药性等，因此外排泵抑制剂主要通过与竞争性抑制转运蛋白的结合位点、干扰外排泵蛋白的组装、阻断供能效应、抑制底物通过外排泵通道等机制，可恢复其对抗菌药物敏感性、防止新的突变株出现以及减少生物膜形成。近年来外排泵抑制剂得到广泛研究，例如吡喃吡啶、拟肽类和吲哚衍生物等[37-38]，到目前为止还没有临床获批的外排泵抑制剂，主要原因是体内药效低、药动学性质差及毒性问题，同时细菌存在多种外排泵且底物广谱，为开发有效的外排泵抑制剂带来了难题。